γ-聚谷氨酸防晒纳米粒子的制备及性能
发布时间：2021-10-08
摘要以天然大分子γ-聚谷氨酸(γ-PGA)为原料，使用疏水小分子L-苯丙氨酸乙酯(L-phe)对其进行改性得到双亲大分子，通过大分子自组装的方法负载阿伏苯宗(AVB)、甲氧基肉桂酸异辛酯(OMC)和二苯甲酮-3(BP-3)3种有机防晒剂得到γ-PGA防晒纳米粒子，并对其光稳定性、广谱防晒性、皮肤渗透性和细胞毒性进行了研究。结果表明，紫外辐照后，与未负载的有机防晒剂组合物相比，γ-PGA防晒纳米粒子在UVA范围的吸光度从12%降低至3%，在UVB范围的吸光度从18%降低至4%，光稳定性得到了提升。同时，制备的防晒纳米粒子在整个紫外波段具有广谱防晒性、低皮肤渗透性和低细胞毒性。将该防晒纳米粒子应用于防晒霜配方中，当添加量为配方总质量的10%时，防晒霜防晒指数(SPF)可达75。
关键词防晒;γ-聚谷氨酸;纳米粒子;光稳定性;自组装;日化原料
紫外线辐射会对人体造成红斑、水肿等短期炎症反应和皮肤光老化、免疫抑制以及皮肤癌等长期影响[1-3]。为了抵挡紫外线对皮肤的伤害，常使用防晒霜进行防护。防晒霜的有效成分主要是防晒剂，防晒剂主要有无机防晒剂和有机防晒剂两类。无机防晒剂主要通过反射、散射紫外线达到防晒效果，但其肤感厚重黏腻，且光催化活性高，限制了其在化妆品领域的应用[4]。有机防晒剂主要通过对紫外线的选择性吸收而起到防晒作用，由于其防晒能力强而且可通过组合达到广谱防晒效果等优点而被广泛用于防晒霜中[5-6]。然而绝大多数有机防晒剂光稳定性差，会发生光化学反应而产生过敏或毒性降解产物，进而降低其紫外线防护能力[7]。因此，高稳定性是有机防晒剂有效性的重要条件。
为解决上述问题，国内外研究者已开发出微胶囊[8-9]、脂质载体[10]、多孔聚合物微球[11-12]、聚合物纳米粒子[13-15]等负载体系以提高有机防晒剂的光稳定性。其中，聚合物纳米粒子由于结构稳定、尺寸易调节以及适用性广等具有独特优势，但目前仍存在合成复杂、不可降解以及潜在生物毒性等问题。大分子自组装是构筑单元之间通过相互作用自发形成有序结构的过程，利用大分子自组装可以方便地制备各种形态的纳米或微米尺度聚集体[16]，还可以将大分子与有机防晒剂进行共组装制备防晒纳米粒子。γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种具有良好生物相容性和生物可降解性的亲水性生物大分子，已被广泛应用于医药领域[17-18]和化妆品领域[19-20]。
常用的有机防晒剂多为疏水性分子，与γ-聚谷氨酸作用力弱，在纳米粒子中的负载量有限。为了解决这些问题，本课题采用疏水小分子L-苯丙氨酸乙酯(L-phe)对γ-PGA进行改性得到双亲聚合物γ-PGA-L-phe，再通过简单易行的大分子自组装的方法，使得到的双亲聚合物在亲疏水作用下负载多种有机防晒剂制备γ-PGA防晒纳米粒子，制备示意图如图1所示。评估防晒纳米粒子的光稳定性、广谱防晒性、皮肤渗透性和细胞毒性，最后探索其在防晒霜中的应用。
1实验部分
1.1试剂与仪器
γ-聚谷氨酸(Mw=200000~500000)，分析纯，日本和光纯药工业株式会社;1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳酰二亚胺(WSC)、L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐(L-phe)，质量分数>98%，阿拉丁试剂(上海)有限公司;阿伏苯宗(AVB)、甲氧基肉桂酸异辛酯(OMC)、二苯甲酮-3(BP-3)，质量分数>98%，上海麦克林生化科技有限公司;氯化钠，分析纯，阿拉丁试剂(上海)有限公司;二甲基亚砜(DMSO)、磷酸盐缓冲液速溶颗粒(PBS，pH=7.4)、NaHCO3、乙醇，分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
Nicolet6700全反射红外光谱仪，美国ThermalFisherScientific公司;AVANCE12HD400MHz核磁共振波谱仪，德国Bruker公司;Nano-ZS纳米粒度及Zeta电位分析仪，英国Malvern公司;JEM-2100plus透射电子显微镜(TEM)，日本电子株式会社;TU-1901双光束紫外-可见分光光度计，北京普析通用公司;XLite600型闸门式UV烘箱，立昕科技股份有限公司;TK-12D透皮扩散试验仪，上海锴凯科技贸易有限公司;Ultimate3000RS超高效液相色谱仪，美国赛默飞世尔科技公司;Nikon80i正置荧光显微镜，日本尼康株式会社;InfiniteM200PRO紫外酶标仪，瑞士Tecan集团;UV-2000紫外线透过率分析仪，美国Labsphere公司。
1.2方法
1.2.1γ-PGA-L-phe的合成
γ-PGA-L-phe参照文献[21]方法合成，不同之处为，使用的NaHCO3溶液浓度为50mmol/L，双亲聚合物γ-PGA-L-phe的产率为82%。
1.2.2γ-PGA防晒纳米粒子的制备
负载不同质量分数的单种有机防晒剂的纳米粒子的制备：在质量浓度为10g/L的γ-PGA-L-phe聚合物溶液中，分别加入质量分数为10%、20%、30%、40%、50%的有机防晒剂AVB、OMC和BP3，取该聚合物溶液与0.1mol/L的NaCl溶液以1∶1的体积比进行自组装获得胶体粒子溶液，将上述胶体粒子在去离子水中透析2d(截留分子量8KD~14KD)，获得分别负载不同含量的三种防晒剂的γ-PGA纳米粒子水分散液，用于三种有机防晒剂的负载量与负载率测定。
负载三种有机防晒的纳米粒子的制备：为了使得制备的纳米粒子在280~400nm范围内具有较好的广谱防晒能力，取质量比为5∶2∶3的AVB、OMC和BP-3溶于质量浓度为10g/L的γ-PGA-L-phe的溶液中，并控制有机防晒剂的质量含量为40%，按照相同方法得到了负载三种防晒剂的γ-PGA防晒纳米粒子水分散液。作为对比，同时合成了不含有机防晒剂的空白纳米粒子。
1.3表征与性能测试
γ-PGA-L-phe结构表征：采用傅里叶红外变换光谱仪，通过衰减全内反射法(ATR)获得聚合物在650~4000cm-1范围内的红外光谱，每个光谱扫描32次，光谱分辨率为0.056cm-1;以氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)为溶剂，以四甲基硅烷(TMS)为内标，利用核磁共振波谱仪测定双亲大分子的核磁氢谱，并依据特征峰积分面积之比计算出小分子L-phe对γ-PGA主链的改性率。
胶体粒子的尺寸及形貌：将胶体粒子的溶液稀释合适倍数后使用纳米粒度及Zeta电位分析仪测定胶体粒子的粒径以及粒径分布情况;将胶体粒子水分散液滴于铜网上，在室温下自然干燥，使用TEM在200kV下观察干态胶体粒子形貌。
纳米粒子的负载量与负载率测定：采用离心法[22]测定聚合物纳米粒子的负载量与负载率。将1.2.2制备的负载不同质量分数的单种有机防晒剂的纳米粒子分散液放入离心机以12000r/min离心1h，除去上清液获得沉淀即为γ-PGA纳米粒子，再加入1mLDMSO溶解，用双光束紫外-可见分光光度计测量其吸光度。
光稳定性及广谱防晒性：将γ-PGA防晒纳米粒子水分散液稀释到适宜浓度，并分别配制相应浓度的未负载的AVB、OMC和BP-3三种有机防晒剂的混合溶液.使用闸门式UV烘箱在距离灯管光照度计80mm高度处照射负载防晒剂的纳米粒子水分散液和未负载的有机防晒剂溶液400s(相当于平均暴露于太阳光4h[13]).使用紫外-可见分光光度计测定照射前后纳米粒子水分散液和未负载的有机防晒剂溶液的紫外吸光度在320~400nm(UVA)和280~320nm(UVB)区域降低的百分比来表征有机防晒剂的光稳定性。
皮肤渗透性：取一块新鲜猪皮，去除毛和皮下脂肪层后，用PBS缓冲液(pH=7.4)浸泡冲洗后剪成边长为2.5cm的正方形。将猪皮置于Franz扩散池的进样池和接收池之间，其中角质层面向进样池。在进样池中分别加入γ-PGA防晒纳米粒子水分散液和未负载的三种防晒剂的DMSO混合溶液1mL，使溶液均匀地完全覆盖猪皮，在接收池中加入体积比为1∶1的无水乙醇和PBS缓冲液的混合溶液。将组装好的Franz扩散池置于透皮扩散仪中，在35℃，转速为500r/min的条件下实验。2、4、8h后分别取50μL接收液待测，同时补给新鲜的接收液。通过超高效液相色谱仪(HPLC)测定接收液中有机防晒剂的浓度，进样量为5μL，并将UV检测器波长设定为260nm。流动相由甲醇-水〔V(甲醇)∶V(水)=9∶1〕组成，流速为1mL/min。每组实验重复3次以确保测试结果的准确性。
细胞毒性测试：参照文献[23]中方法进行细胞毒性测试。选用鼠胚胎成纤维细胞(L929)作为评价细胞。研究了γ-PGA防晒纳米粒子的不同含量(10%，30%)与不同培养时间(24、48h)对L929细胞生长状态及细胞活力的影响。
防晒指数测试：分别使用γ-PGA防晒纳米粒子和相同含量的未负载的三种防晒剂的混合物制备防晒霜，控制这两种成分在防晒霜配方中所占含量均为防晒霜配方整体含量的10%，配方如表1所示。参照文献[24]方法进行防晒指数测试。具体是：将所制得的防晒霜均匀涂覆于5cm×5cm的甲基丙烯酸甲酯(PMMA)板上，保持其涂覆量为2mg/cm2，每个样品涂覆4块PMMA板。将涂覆完成的PMMA板于暗室中静置15min，取出置于紫外线透过率分析仪上在260~400nm下测试防晒霜的SPF值。分别测试每块PMMA板上防晒霜的SPF值，每个PMMA板取五个点进行测试，最后取其平均值。此外，用同样的方法也测试了经闸门式UV烘箱照射400s(相当于平均暴露于太阳光4h[13])后防晒霜的SPF值。
2结果与讨论
2.1γ-PGA-L-phe的结构表征
γ-PGA-L-phe为γ-PGA主链上的—COOH与L-phe上的—NH2通过酰胺化反应制得。反应过程中，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳酰二亚胺(WSC)可将—COOH转换为具有氨基反应活性的酯，若酯基未能及时发生酰胺化反应，则将发生水解转变为羧基。图1为γ-PGA和γ-PGA-L-phe的红外谱图。在γ-PGA的FTIR谱图中，3280cm-1和2920cm-1处为—OH和—NH的特征峰;1730cm-1处为羧基中—C=O的特征峰;1530cm-1处为C—N的特征峰。经L-phe改性后，在1640cm-1处出现新峰，该峰为酰胺键上—C=O的特征峰，初步表明γ-PGA-L-phe被成功制备。
图3为γ-PGA-L-phe的核磁共振氢谱。从图3可以看出：δ0.9~1.2为L-phe上酯键末端甲基氢的信号峰;δ1.5~2.2为γ-PGA主链上亚甲基氢的信号峰;δ3.0为L-phe上与苯环相连的碳上亚甲基氢的信号峰;δ4.0处为L-phe上与酯键相连的亚甲基氢的信号峰;δ4.2~4.4处为γ-PGA主链上与氨基相连的碳上氢的化学位移;δ4.5处为L-phe上与氨基相连的碳上氢的信号峰，δ7.1~7.4为L-phe上苯环中氢的信号峰;δ7.4~7.8处为γ-PGA主链上氨基上氢的信号峰;δ8.0处为新生成的酰胺键中氨基上氢的信号峰，证明了γ-PGA-L-phe被成功制备。用L-phe上苯环中的氢和γ-PGA主链上与氨基相连的碳上的氢的积分面积之比计算得出L-phe对γ-PGA的改性率为79%。
2.2胶体粒子的尺寸及形貌表征
随着NaCl水溶液的加入，溶解在DMSO中的双亲性γ-PGA-L-phe大分子在亲疏水作用下发生自组装形成纳米粒子，同时对有机防晒剂进行负载，得到γ-PGA防晒纳米粒子。使用纳米粒度及Zeta电位分析仪对γ-PGA防晒纳米粒子的粒径及分布进行表征，结果见图4。如图4所示，空白纳米粒子的粒径为(73.3±0.6)nm，而负载防晒剂的胶体粒子粒径为(96.1±0.4)nm，粒径的增大间接表明了纳米粒子对有机防晒剂分子的有效负载。
相关期刊推荐：《精细化工》(月刊)创刊于1984年，是中国化工学会精细化工专业委员会、中国精细化工协会(筹)会刊，由大连化工研究设计院(原化工部大连化工研究设计院)等单位主办，是中国化工、轻工类核心期刊。设有： 功能材料、电子化学品、生物工程、催化与分离技术、表面活性剂、食品与饲料添加剂、香料与香精、医药与日化原料等栏目。
进一步使用TEM对γ-PGA防晒纳米粒子的形貌进行表征，结果见图5。如图5所示，胶体粒子呈球形，且分散较为均匀，这表明纳米粒子对防晒剂的负载比较均一。与图5a空白纳米粒子对比可以看出，图5b中负载有机防晒剂后胶体粒子粒径明显变大，这与纳米粒度仪的测定结果一致。然而与纳米粒度仪所测粒径相比，TEM所测粒径较小，其中未负载防晒剂的胶体粒子粒径约为60nm，负载防晒剂的胶体粒子粒径约为80nm。这主要是由于胶体粒子在水溶液中处于溶胀状态，粒径较大，当胶体粒子溶液存在于铜网上时，随着溶剂的挥发，胶体粒子发生塌陷收缩，导致测量的粒径偏小。
2.3负载率与负载量测定
为了证明本文采用双亲性γ-聚谷氨酸聚合物对有机防晒剂负载策略的通用性，选用了阿伏苯宗(AVB)、甲氧基肉桂酸异辛酯(OMC)和二苯甲酮-3(BP-3)三种比较常见的有机防晒剂作为代表。另一方面，AVB、OMC、BP-3的紫外最大吸收波长分别在360、310和290nm处，通过三者合理复配可以在280~400nm范围内达到广谱防晒的效果，实现全方位的紫外防护。但是，由于三种有机防晒剂紫外吸收光谱的相互交叉，无法计算同时负载三种防晒剂的纳米粒子的负载率和负载量。为了探究具有最佳负载率和负载量的纳米粒子时有机防晒剂与双亲聚合物的质量比，我们通过离心法分别测试了纳米粒子对每种防晒剂的负载率和负载量。从图6可以看出，纳米粒子对有机防晒剂的负载量随着有机防晒剂质量分数的增加而增加;当AVB、BP-3和OMC三种防晒剂质量分数为40%时具有最大的负载率，分别为78.3%、84.6%、87.9%。因此，选用此条件制备同时负载三种有机防晒剂的γ-PGA防晒纳米粒子。
2.4光稳定性及广谱防晒性表征
紫外线辐照前后防晒纳米粒子的紫外吸收曲线见图7。AVB、OMC、BP-3三种有机防晒剂的最大吸收波长分别在360、310及290nm处。由图7可以看出，制备得到的防晒纳米粒子可以在280~400nm范围内达到广谱防晒的效果。由图7a、b可以看出，负载对有机防晒剂的紫外线吸收能力影响很小，聚合物纳米粒子负载的三种有机防晒剂在整个UVA/UVB波段具有优异的广谱防晒效果。紫外光照射之后，未负载的三种有机防晒剂组合物吸光度在UVA(320~400nm)和UVB(280~320nm)区域分别降低了12%和18%，而γ-PGA防晒纳米粒子的吸光度在UVA和UVB区域仅降低了3%和4%。通过γ-PGA纳米粒子对有机防晒剂进行负载，双亲聚合物结构中的苯环可能与有机防晒剂存在相互作用，且防晒剂被纳米粒子分隔开来，使得有机防晒剂与相邻分子的相互作用相对受限，这些作用有效地降低了不利于有机防晒剂发挥作用的光化学反应，提升了光稳定性。
2.5皮肤渗透性表征
使用Franz扩散池来表征γ-PGA纳米粒子对有机防晒剂的负载对皮肤渗透性的影响，结果如图8所示。未负载的有机防晒剂从2h开始通过皮肤组织进入接收器溶液，且随着时间增长，接收液中有机防晒剂的浓度显著增大。而γ-PGA纳米粒子负载之后，接收液中有机防晒剂的浓度大大降低。该结果表明，γ-PGA纳米粒子的负载可以有效降低有机防晒剂的皮肤渗透性，提升有机防晒剂的使用安全性。
2.6细胞毒性测试
通过荧光染色法研究不同体积含量(10%，30%)的γ-PGA防晒纳米粒子和不同培养时间(24h，48h)对L929细胞生长状态的影响来表征其细胞毒性。结果如图9a所示。当L929细胞与RPMI1640细胞培养液(阴性对照组)培养24或48h后，细胞形态较为伸展，说明此时细胞生长状态良好;当L929细胞与仅添加DMSO的培养液(阳性对照组)培养24或48h后，细胞形态收缩且数量大大减少，说明在此条件下细胞生长受到明显限制;当L929细胞与10%防晒纳米粒子分散液培养24或48h后，细胞形态与阴性对照组细胞形态相同，无畸形变化。加入30%防晒纳米粒子分散液与加入10%防晒纳米粒子分散液时细胞生长状况基本相同。
进一步使用MTT法[25]评价细胞活性。图9b、c为加入不同含量纳米粒子样品细胞活力值的计算结果。RPMI-1640作为阴性对照组，其细胞相对增殖度(RGR)值为100%。仅添加DMSO的培养液作为阳性对照组，其RGR值低于40%。相比于阴性对照组，在加入10%和30%纳米粒子分散液培养24和48h后L929细胞的活性均>97%，这说明γ-PGA防晒纳米粒子不会影响细胞增殖，基本无细胞毒性，这与图9a结果一致。——论文作者：梁雪，孟宇寰，刘晓亚，李小杰
