常用分子标记在植物科学研究中的应用

发布时间：2022-01-07

　　摘 要：介绍了常用的分子标记种类，如RFLP、RAPD、AFLP、SSR等，并分析了其在植物科学研究中的应用。

　　关键词：分子标记;植物科学;应用

　　广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义的分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段 [1];指受基因控制并且能够稳定遗传的，能代表个体或群体的遗传特征，并可被用作遗传分析的物质[2]。它能够直接反映基因组间DNA间的差异。常用的分子标记有RFLP、 RAPD、AFLP、SSR、ISSR、EST等。RAPD、AFLP属于以PCR 为基础的分子标记;RFLP属于以Southern为基础的分子标记;SSR、ISSR属于以重复序列为基础的分子标记;EST以 mRNA为基础的分子标记[1]。分子标记技术，即分子诊断技术，也是指通过直接分析遗传物质的多态性来诊断生物内在基因排布规律及其外在性状表现规律的技术[3]。

　　1 常用分子标记的种类介绍

　　1.1 限制性片段长度多态性(restiction fragment length polymorphism，RFLP)

　　限制性多形性碎片长度基于传统 Southern杂交技术的分子标记，它是利用限制性内切酶识别特定的核苷酸顺序并切割DNA后，由于酶识别序列的点突变或部分DNA片段的缺失、插入、倒位而引起酶切位点缺失或获得，使切割 DNA所得的片段发生变化，从而导致限制性片段的多态性 [2]。具有特异性的DNA片段可通过 Southern杂交检测出来，但 RFLP标记对DNA需要量较大(5 ～ 10ug)，操作繁琐，费用昂贵，只适应单/低拷贝，使其应用受到一定程度的限制[4]。

　　1.2 随机扩增多态性(Random Amplified Polymorphismic DNA，RAPD)

　　Williams等在发现 RAPD多态性并证明 RAPD标记分离符合孟德尔遗传规律，是一种有效的遗传标记。该标记技术是以人工合成的随机寡聚核苷酸序列为引物，通常为 10个碱基，利用 PCR技术随机扩增基因组DNA模板的不同位点，得到一系列多态性 DNA片段，经染色后，即可进行多态性分析[2]。RAPD的特点是：无需知道有关模板 DNA的结构信息;无种属特异性，一套引物可适用于不同的基因组分析;模板 DNA用量少(15 ～ 25ug)，纯度要求不高。其缺点为不能区分纯合型和杂合型及结果重复性较差[4]。

　　1.3 扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)

　　扩增片段长度多态性是Zabeau等于1992年发明的一项专利技术。它是基于PCR的RFLP技术，植物基因组DNA经 2个限制性内切酶酶切后，与特定接头相连接，根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，进行特异性PCR扩增，最后分离扩增的DNA片断[2]。AFLP兼具RFLP和RAPD的优点，被认为是迄今为止最有效的分子标记。其优点如下：具较高的可靠性和高效性、具有共显性和显隐性、多态水平最高、检测位点最多、操作简便、分子认别率最高、速度快、 Tm 值高、DNA用量少等[4]。但AFLP也存在一些缺陷，对模板反应迟钝，谱带可能发生错配与缺失，成本较高，对技术要求高等[5]。

　　1.4 简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)

　　简单重复序列又称微卫星序列，指DNA分子中2 ～ 4个核苷酸串连重复序列分布于人类和动植物整个基因组的不同位置上，不同品种间其重复长度有高度的变异性，但微卫星 DNA两端的序列多是保守的单拷贝序列，根据两端的序列设计一对特异引物，经PCR扩增，PAGE电泳及放射自显影，可以得到因简单序列重复单位数不同而引起的扩增片段的多态性，即获知不同个体在这个位点上由于基本单元重复次数不同而形成的多态性[6]。但要获得SSR引物需要进行大量克隆、测序和杂交验证，难度较大且代价昂贵。 SSR标记是较为理想的分子标记，具备多态性丰富、重复性好、多呈现共显性、易于使用等特点，是目前应用最广的标记。

　　对于微卫星 DNA可以使其特异地定位于染色体的某一位置，然后用与两侧保守的 DNA序列互补的方式设计出特定的寡核苷酸引物对基因DNA进行PCR扩增[7，8] 。

　　2 分子标记在植物科学研究中的应用

　　2.1 构建分子图谱和 DNA指纹分析

　　目前利用不同种类的分子标记开展中草药植物的种属分类工作取得了很大的进展，以RAPD标记较多见[9]。目前已利用RFLP标记建立了一些主要作物的RFLP连锁图，其中包括：玉米、番茄、马铃薯、莴苣、大豆、水稻、大麦、小麦等。此外，RAPD标记还成功地用于检测植物基因组 DNA的遗传变异及品种鉴定[10]。由于 RFLP只适合单/低拷贝，其使用受到限制，RAPD、AFLP能对整个基因组适应，从而能广泛应用于构建分子图谱和DNA指纹分析。陈洪等利用 RAPD建立了水稻分子连锁图谱，并且用 AFLP 对8种致病性念珠苗构建 DNA指纹图谱，尹佟明等利用 AFLP对美洲黑杨无性系进行 DNA指纹分析，Lin和 Jona thanKuo对不同生态型的拟南芥和不同大肠杆菌菌株进行 AFLP分析，Herman J.Varek同样对马铃薯远缘杂交子代构建了AFLP的分子图谱，以上分子图谱构建为基因定位、分子克隆等奠定了基础[2]。2003年Isobo等构建了三叶草的第1张基于cDNA探针的RFLP遗传图谱[11]。la Rosa R[12] 等用RAPD、AFLP、RFLP和SSR技术构建了第1张橄榄的遗传图谱。

　　Gao等利用小麦3个作图群体(W7984×Opata85、Lumai ×Hanxuan、Wenmai×Shanhongma1)对 478个EST.SSR引物进行了筛选，将88个引物的101个位点定位在硬粒小麦的20个染色体上(染色体4B除外)，这一结果使得原有的小麦遗传图谱增至到 450个SSR位点。

　　2.2 基因定位

　　RFLP、RAPD、AFLP都可以对基因进行定位，RFLP分子标记的基因定位主要有：以标记为基础的分析法(M法)以性状为基础的分析法(riB法)，区间作图法。利用RAPD进行基因定位，目前有两种方法：近等位基因系的基因定位，利用个体目的基因分离进行基因定位，1995年小麦抗白粉病基因 Pm4a和水稻光敏核不育基因的 RAPD定位均已报道，石永刚等将玉米s组细胞质雄性不育(CMS)育性恢复基因利用RFLP、RAPD方法进行定位。

　　2.3 遗传多样性和物种亲缘关系

　　在水稻中 Wang和Tanksley应用 RF'LP对70个水稻品种进行了亲缘关系分析;在柑桔方面，萧顺元进行了多样性研究;Koratsu等人进行了种属起源与进化关系的研究;在花生方面 Gary Kocheet等人应用10个引物对29个花生野生种进行了亲缘关系分析;陈洪等利用 AFLP建立了8种致病性念珠菌分子图谱。分子标记为种质资源的收集、保存等以及探索物种起源奠定基石。

　　2.4 种质鉴定和遗传背景分析

　　分子标记可以鉴别品种，分析农艺性状基因，确定染色体同源性，对异源染色体和染色体结构畸变的检测。在育种学上进行标记辅助选择，对抗病基因的快速鉴定，远缘杂种异源染色体DNA检测等。这些研究更加有利于种质资源的保存。

　　3 展望

　　分子标记技术是从生物遗传物质DNA分子上揭示物种遗传变异以及其变异的规律，揭示可能存在的遗传变异规律。这些研究更加有利于种质资源的保存以及分子生物学研究，揭示生命规律。——论文作者：孙芳芳

　　参考文献

　　[1]汪 伟，赵卫国，等. DNA 分子标记在植物上的应用进展[J].安徽 农学通报，2006，12(7)：39 -41.

　　[2]张阵阵，郭美丽，张军东.分子标记技术及其在药用植物中的应用 [J].药学实践杂志.2007，25(3)：137-140.

　　[3]Sambrook J，Firtsch E F，Maniatis T.Molecular Cloning：A Laboratory 　Manual[M].Glod Spirg Harbor Laboratory Press，2000.

　　[4]王和勇，陈 敏，廖志华，等.RFLP、RAPD、AFLP分子标记及其在 植物生物技术中的应用[J]. 生物学杂志， 1999，16(4)：24-26.

　　[5]Tomoke M，Mitsuo 0，Tomoya A.Distirbution of urtaceae specific repeated sequences isolated from citurs genomes[J].Ann Bot，2001 (87)：845.

　　[6]赵 雪，谢 华，马荣才.植物功能基因组研究中出现的新型分子 标记[J].中国生物工程杂志.2007，27(8)：104-110..

　　[7]杨 进.SSR标记技术在植物遗传多样性研究上的应用[J].中国农 学通报，2006，22(7)：90-93.

　　[8]郭瑞星，刘小红，等.植物 SSR标记的发展及其在遗传育种中的应 用[J]. 2005，13(2)：8-11.

　　[9]黄璐琦.分子生药学[M].北京：北京医科大学出版社，2000(5)： 228 -254.

　　[10]乔爱民，傅家瑞. 分子标记在植物上的应用[J]. 长江蔬菜，1999 (4)：1-4.

　　[11]Isobe S，Klimenko I，Ivashuta S，et al. First RFLP linkage map of red clover(Trifolium pratense L.)based on cDNA probes and its transferability to other red clover germplasm[J].Theor Appl Genet， 2003(108)：105-120.

　　[12]la Rosa R，Angiolillo A，Guerrero C，et al. A first linkage map of olive(Olea europaea L.)cultivars using RAPD，AFLP，RFLP and SSR markers[J]. Theor Appl Genet，2003(106)：1 273-1 282.