双叶细辛甲醇提取物对12种农业病原真菌抑菌活性研究
发布时间：2021-09-17
摘要：【目的】研究了双叶细辛甲醇提取物对 12 种植物病原真菌的抑菌活性，为双叶细辛发展为新型植物杀菌剂提供实验依据和理论基础。【方法】采用生长速率法测定双叶细辛对 12 种植物病原真菌的抑制活性，结果表明在 1 mg/mL 浓度下，双叶细辛甲醇提取物对 12 种病原真菌表现出不同程度的抑制活性,并且测定了双叶细辛甲醇提取物对抑菌率在 70%以上的病原菌的 EC50，根据结果测定了双叶细辛甲醇提取物对香蕉炭疽病菌的孢子萌发率以及离体实验。【结果】实验结果表明:双叶细辛甲醇粗提物对火龙果黑斑病菌的抑制效果最好，抑制率为 100%，EC50为 0.188 mg/mL。双叶细辛石油醚相对香蕉炭疽病菌抑制效果最好，抑制率为 99.51%，EC50 为 0.202 mg/mL。双叶细辛乙酸乙酯相对香蕉炭疽病菌的抑制效果最好，抑制率为 99.95%，EC50 为 0.099 mg/mL。浓度在 2、4 和 8 mg/mL 时，双叶细辛甲醇提取物以及石油醚相对香蕉炭疽病菌分生孢子萌发相对抑制率均在 60%以上，双叶细辛乙酸乙酯提取物对香蕉炭疽病菌分生孢子萌发相对抑制率在 90%以上。离体实验结果表明双叶细辛石油醚相以及乙酸乙酯相对香蕉果实炭疽病有较好防治效果，在浓度为 10 mg/mL 时防治效果优于 0.2 mg/mL 的多菌灵。【结论】双叶细辛甲醇提取物对多种植物病原菌具有较强的抑菌活性，具有抑菌广谱性，可以开发成为植物源抑菌剂。其中双叶细辛甲醇提取物石油醚和乙酸乙酯萃取相均对香蕉炭疽病菌表现出优良的防治效果，推测双叶细辛中存在对香蕉炭疽病菌具有较强拮抗活性的物质，这一发现对将来双叶细辛开发成为防治香蕉炭疽病的有效杀菌剂提供了一定的理论基础。
关键词：双叶细辛;中药提取物;植物病原真菌;抑菌活性
【研究意义】细辛属植物作为中药材，主要有止咳平喘、消炎镇痛、抗菌抗病毒、抗癌细胞、抗氧化抗衰老、免疫调节(免疫活化或免疫抑制)以及对心血管和神经系统的影响等。[1,2]。其中众多细辛属植物中，作为中药细辛应用的主要是辽细辛(Asarum heterotropoides Fr. Schmidt var. mandshuricum(Maxim.)Kitag)和华细辛(Asarum sieboldii Miq.i)的干燥全草。虽然辽细辛和华细辛在医药方面以及农业方面具有很好的效果，但是辽细辛和华细辛生长缓慢，炮制工艺复杂，价格偏贵，因此其他多种地产细辛亦可入药，这类细辛统称为土细辛，双叶细辛是土细辛的一种[3,4]。双叶细辛(Asarum caulescens Maxim)为马兜铃科(Aristolochiaceae)细辛属(Asarum)植物，别名：土细辛、乌金草，主要分布于我国陕西、甘肃、湖北、四川、贵州。民间手抄本记载双叶细辛具有行气镇痛之功效，鄂西北山区民间常用于治疗胃痛、腹痛、胸疼痛等痉挛性疼痛病症[5]。由于合成农药潜在的健康和环境风险，再加上其非选择性和抗虫性，人们对更安全和可生物降解的虫害防治替代品的需求越来越大。植物源农药因其非持久性、高选择性和低哺乳动物毒性而成为一种很有前途的替代品。目前国际上都在号召应用绿色农药替代传统农药，生产出活性高、成本便宜、对环境影响较小、对人类无害的新型农药已成为农药研究的主要内容，而植物源农药因其本身具有的大量优点使其成为新型绿色农药的研究热点[6,7]。【前人研究进展】双叶细辛通常被应用在医药方面，有民间手抄本记载双叶细辛具有行气镇痛之功效，鄂西北山区民间常用于治疗胃痛、腹痛、胸疼痛等痉挛性疼痛病症[8]。有研究报道辽细辛的乙醇提取物具有较好体外抗炎活性[9,10]。朱顺英运用 GC/MS 测定了双叶细辛挥发油的成分，并发现了双叶细辛挥发油对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、3 种酵母菌等具有良好抑制活性，可以应用临床药学研究中[3]。在农业防治上，刘南南等发现辽细辛精油对瓜类果斑病菌具有一定的抑菌效果[11]。刘海燕等发现细辛挥发油对对白菜叶斑病菌(Alternaria brassicae)、葡萄孢霉(Botrytis cinerea)、茄立枯病菌(Rhizoctonia solani)表现完全抑制作用，对人参疫霉菌(Phytophthora cactorum)、绿色木霉菌(Trichoderma viride)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、燕麦镰孢(Fusarium avenaceum)抑制作用相对较强[12]。杨银书等发现华细辛挥发油对媒介硬蜱的若虫和成虫、黄胸散白蚁、南方根结线虫 2 龄幼虫等都有一定的抑制和毒杀效果[13]。
【本研究切入点】目前关于双叶细辛的研究主要集中在药用价值以及医学研究方面，而在农业方面的研究应用报道较少[3]。从植物中分离纯化具有农用活性的天然化合物，以此先导化合物为结构模板，进行结修饰、优化、合成，从而研发出高效低毒的新型农药是植物农药的研究重点[14]。【拟解决的关键问题】双叶细辛由于分布广泛，价格相较华细辛和辽细辛便宜，因此通过对双叶细辛甲醇提取物对 12 种热带常见农业病原真菌展开抑菌活性研究，以期为热带农业植物病原菌防治提供理论基础及技术支撑。
1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1 双叶细辛 双叶细辛中药材购自安徽毫州皖北赵氏药业，由华南农业大学李秉涛教授鉴定，标本保存在海南大学植物保护学院，编号 20200525。
1.1.2 供试菌种 苹果轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea)、香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、芒果蒂腐病菌(Botryodiplodia theobromae)、芒果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz)、芒果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、火龙果黑斑病菌(Bipolaris cactivora (Petrak)Alcorn)、水稻稻瘟菌(Pyricularia oryae Cavara.)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum Schwabe)、橡胶炭疽病菌(Colletotrichum siamense)、香蕉枯萎病菌 4 号生理小种(Fusarium oxysporum f. sp. cubense Race 4)、椰子可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)。以上菌种均由海南大学植物保护学院提供，菌种保存于 4 ℃冰箱，活化后备用。
1.2 方法
1.2.1 双叶细辛粗提物的制备 采用冷浸提法[15]，将采购于安徽毫州皖北赵氏药业的 1 kg 双叶细辛置于电热恒温鼓风干燥箱中，控温(50±2) ℃烘干后，经粉碎机粉碎，将粉碎后粉末置于甲醇中浸泡，溶剂：干粉 =5:1(体积/质量)，3 d 后抽滤，滤液在 60 ℃减压蒸馏浓缩，即得到甲醇粗提取浸膏，残渣再加入同量的甲醇继续浸泡，反复三次，合并三次浸提膏，得到双叶细辛甲醇粗提取浸膏。将甲醇浸膏加适量的超纯水溶解，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取，将各相旋转蒸发至膏状即得到石油醚相、氯仿相以及乙酸乙酯相，剩下即为水相，置于冰箱 4 ℃保存，备用。
1.2.2 双叶细辛各相萃取物对植物病原真菌菌丝生长抑制活性测定 采用生长速率法[16-17]，测定双叶细辛提取物对供试病原真菌的抑菌活性。称取 2 g 的双叶细辛各相萃取物分别溶解于 4 mL N，N-二甲基甲酰胺中，然后在超净工作台中各取 400 μL 溶解后分别融于 199.6 mL 已冷却至 50 ℃的 PDA 培养基中，配置终浓度为 1 mg/mL 的带药培养基，倒入直径 9 cm 的培养皿中冷却凝固，以仅加入等量 N，N-二甲基甲酰胺的 PDA 培养基作为空白对照。取在 PDA 培养基上预先培养好的病原菌，在菌落边缘用直径 5 mm 的打孔器切取生长一致的菌饼，移植到培养皿的中心。
1.2.3 双叶细辛各相萃取物对植物病原真菌菌丝生长的 EC50测定 选取抑制率在 70%以上的供试病原菌测定 EC50。用一定量 N，N-二甲基甲酰胺溶解各相待测萃取物，并用 0.5%吐温-80 水溶液稀释成 1000、500、 250、125、62.5 mg/mL 系列浓度梯度的母液，将配置好的母液用 0.22 μm 针头过滤器过滤，然后在超净工作台中各取 0.1 mL 母液加入 49.9 mL 已冷却至 50 ℃的 PDA 培养基中，配成最终浓度为 2 mg/mL、1 mg/mL、 0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL 的带药培养基，接种方法同 1.2.2。
1.2.4 双叶细辛甲醇提取物和各相萃取物对香蕉炭疽病菌分生孢子萌发相对抑制率测定 采用琼脂平板表面萌发法，取长势良好的香蕉炭疽病菌，用无菌水配制成 1×107 cfu/mL 的孢子悬浮液。用一定量的 N，N二甲基甲酰胺溶解各萃取相，并用 0.22 μm 针头过滤器过滤，然后用 0.5%吐温-80 水溶液稀释，配置成终浓度分别为 8、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL 的药液。用无菌打孔器打取水琼脂块置于载玻片上，待凝固后，将配制好的各浓度药液分取 20 μL 均匀涂布于水琼脂块上，而后再取 20 μL 孢子悬浮液滴于培养基表面，用涂布棒涂匀，涂布完成后，将载玻片放置于底部铺有润湿滤纸片的培养皿内，密封放置于微生物培养箱中，28 ℃黑暗条件下培养 6 h，含有相同量的 N，N-二甲基甲酰胺和 0.5%吐温-80 的无菌水作为空白对照，每个处理设 3 个重复，待对照分生孢子萌发 80%以上时，按下述公式计算孢子萌发率。
1.2.5 离体法测定双叶细辛甲醇提取物和各相萃取物对香蕉果实炭疽病的防治效果 将双叶细辛各相萃取物溶于一定量的 N，N-二甲基甲酰胺中，用 0.5%吐温-80 水溶液稀释成 10 mg/mL 的溶液。挑选成熟且形状、大小比较一致、没有破损和病斑的香蕉，清洗表面，晾干备用。用喷壶将各相药液喷施到香蕉表面，每个香蕉喷施 10 mL，用 0.2 mg/mL 的多菌灵作为阳性对照，含有相同量的 N，N-二甲基甲酰胺和 0.5%吐温-80 的无菌水作为空白对照。24 h 后，在香蕉表面喷洒等体积的 1×107 cfu/mL 香蕉炭疽病菌分生孢子悬浮液，将处理后的香蕉放入塑料盒中，用保鲜膜封好，28 ℃培养。7 d 后，观察发病情况并分级，实验进行 3 次，每次实验 3 个重复。
按照以下标准进行分级，即 0 级：无病;1 级：病斑面积占果实面积的 5%以下;3 级：病斑面积占果实面积的 6%～10%;5 级：病斑面积占果实面积的 11%～25%;7 级：病斑面积占果实面积的 26%～50%; 9 级：病斑面积占果实面积在 50%以上。
1.3 数据处理
使用 SPSS.25、Excel.2019 软件分析处理数据进行方差分析、计算毒力回归方程及 EC50。
2 结果与分析
2.1 双叶细辛各相提取物抑菌活性粗筛
通过甲醇浸泡得到甲醇粗提物 125.64 g，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取后得到石油醚相 32.39 g、乙酸乙酯相 16.53 g、水相 79.44 g。从图 1 和表 1 可以看出双叶细辛各相萃取物在 1 mg/mL 的浓度下对供试病原菌均具有一定抑菌活性。双叶细辛甲醇粗提物对各种病原真菌的抑菌率为火龙果黑斑病菌 100%>小麦赤霉病菌99.75%>芒果蒂腐病菌99.72%>番茄早疫病菌95.17%>香蕉炭疽病菌93.13%>苹果轮纹病菌92.20%> 水稻稻瘟病菌 89.31%>芒果炭疽病菌 83.99%>芒果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz)83.46%>可可毛色二孢菌 75.17%>橡胶炭疽病菌 72.73%>香蕉枯萎病菌 59.10%。双叶细辛石油醚相对各种病原真菌的抑菌率为香蕉炭疽病菌 99.51%>芒果蒂腐病菌 97.84%>小麦赤霉病菌 92.37%>水稻稻瘟病菌 91.23%>芒果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz)85.35%>芒果炭疽病菌 85.26%>火龙果黑斑病菌 81.16%>橡胶炭疽病菌 80.68%>苹果轮纹病菌 79.73%>番茄早疫病菌 78.68%>可可毛色二孢菌 74.29%>香蕉枯萎病菌 55.77%。双叶细辛乙酸乙酯相抑菌活性在 70%以上的是香蕉炭疽病菌 99.95%>橡胶炭疽病菌 97.09%>苹果轮纹病菌 81.46%>番茄早疫病菌 76.90%，对芒果蒂腐病菌抑制效果最弱，抑菌率为 0.39%。可以看出双叶细辛甲醇粗提物以及石油醚相对各植物病原菌具有较好抑制活性，特别是对香蕉炭疽病菌、芒果蒂腐病菌、小麦赤霉病菌的抑制活性最好，甲醇粗提物和石油醚相的抑制率都在 90%以上，乙酸乙酯相对香蕉炭疽病菌、橡胶炭疽病菌抑制活性最好，均在 90%以上。
2.2 双叶细辛各相提取物对 11 种病原真菌的 EC50测定
通过 SPSS.25 计算出双叶细辛提取物对 11 种病原真菌的 EC50值[19]，结果如表 2 所示。双叶细辛甲醇粗提物对 11 种病原菌的 EC50 为：番茄早疫病菌 0.096 mg/mL<橡胶炭疽病菌 0.121 mg/mL<芒果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz)0.122 mg/mL<小麦赤霉病菌 0.129 mg/mL<香蕉炭疽病菌 0.143 mg/mL<芒果炭疽病菌 0.158 mg/mL<芒果蒂腐病菌 0.166 mg/mL<水稻稻瘟病菌 0.184 mg/mL<火龙果黑斑病菌 0.188 mg/mL<苹果轮纹病菌 0.199 mg/mL<可可毛色二孢菌 0.437 mg/mL，可以看出双叶细辛甲醇粗提物对番茄早疫病菌的抑制效果最好。双叶细辛石油醚相对 11 种病原菌的 EC50 为：火龙果黑斑病菌 0.117 mg/mL<芒果蒂腐病菌 0.138 mg/mL<小麦赤霉病菌 0.157 mg/mL<苹果轮纹病菌 0.177 mg/mL<橡胶炭疽病菌 0.177 mg/mL<番茄早疫病菌 0.193 mg/mL<香蕉炭疽病菌 0.202 mg/mL<芒果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz)0.217 mg/mL<水稻稻瘟病菌 0.247 mg/mL<可可毛色二孢菌 0.299 mg/mL<芒果炭疽病菌 0.318 mg/mL，可以看出双叶细辛石油醚相对火龙果黑斑病菌的抑制效果最好。双叶细辛乙酸乙酯相对 5 种病原菌的 EC50 为：香蕉炭疽病菌 0.099 mg/mL <橡胶炭疽病菌 0.199 mg/mL <火龙果黑斑病菌 0.252 mg/mL <苹果轮纹病菌 0.447 mg/mL <番茄早疫病菌 0.789 mg/mL，可以看出双叶细辛乙酸乙酯相对香蕉炭疽病菌抑制效果最好。实验结果表明，双叶细辛各相提取物对 11 种病原菌的菌丝生长均具有一定抑制效果，且不同萃取相对同一病原菌的抑菌效果不一样，甲醇粗提物和石油醚相抑菌活性较好，因此推测杀菌活性成分主要集中在甲醇粗提物及石油醚相中。
2.3 双叶细辛甲醇提取物和各相萃取物对香蕉炭疽病菌分生孢子萌发相对抑制率测定
由于双叶细辛甲醇提取物各萃取相对香蕉炭疽病菌的抑制效果明显，于是进行了双叶细辛甲醇提取物和各相萃取物对香蕉炭疽病菌分生孢子萌发相对抑制率的测定，结果如图 2 所示。由图 2A 可知，双叶细辛甲醇提取物对香蕉炭疽菌分生孢子萌发具有一定的抑制活性。随着提取物浓度的增加，其对香蕉炭疽病菌分生孢子萌发的抑制作用显著增强。浓度在 2、4 和 8 mg/mL 时，孢子萌发相对抑制率均在 60%以上，分别为 65.31%、81.04%和 93.28%，浓度为 1 mg/mL 时，对孢子萌发的抑制活性明显下降，孢子萌发相对抑制率为30.48%，浓度为0.5和0.25 mg/mL时，基本无抑制效果，孢子萌发相对抑制率仅为5.27%和3.47%。由图 2B 可知，双叶细辛石油醚萃取相对香蕉炭疽菌分生孢子萌发也具有一定的抑制活性，随着石油醚萃取相物浓度的增加，其对香蕉炭疽病菌分生孢子萌发的抑制作用明显增强，浓度在 2、4 和 8 mg/mL 时，孢子萌发相对抑制率均在 60%以上，分别为 65.16%、73.11%和 98.07%，浓度为 1、0.5 和 0.25 mg/mL 时，对孢子萌发的抑制活性明显下降，孢子萌发相对抑制率分别为 12.09%、 7.16%和 5.42%。由图 2C 可知，双叶细辛乙酸乙酯萃取相对香蕉炭疽菌分生孢子萌发具有一定的抑制活性，浓度在 2、4 和 8 mg/mL 时，孢子萌发相对抑制率均在 90%以上，分别为 97.44%、97.81%和 99.18%，其抑制效果优于同浓度下的甲醇提取物和石油醚萃取相，且与 1、0.5 和 0.25 mg/mL 浓度下的抑制效果差异达到显著性水平。
2.4 离体法测定双叶细辛甲醇提取物和各相萃取物对香蕉果实炭疽病的防治效果
经过双叶细辛石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物处理过的香蕉，一周后仍处于轻微的发病状态，只观察到少量星状病斑，发病程度明显低于经过甲醇处理过的香蕉，而空白对照组的香蕉已经出现大量病斑，开始变黑，甚至腐烂(图 3)。离体法测定双叶细辛甲醇提取物和各相萃取物对香蕉果实炭疽病的防治效果如表 3 所示，经过 10 mg/mL 的双叶细辛甲醇提取物、石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物处理过的香蕉的病情指数分别为 75.66、54.07 和 51.11，而空白对照处理组的香蕉的病情指数为 93.65，在 10 mg/mL 浓度下的双叶细辛石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物对香蕉炭疽病的防治效果分别为 42.27%和 45.42%，其防治效果优于 0.2 mg/mL 的多菌灵。
3 结论与讨论
国内外科研者关于中药材提取物的杀菌活性已经开展了大量的研究，从具有医药效果的中药材出发寻找具有农用活性的有效成分是植物源农药研究的一个创新方向。我国中草药资源丰富，可以为科研研究提供多样原材料，且在植物源农药的研究上也取得了很多的成果，可以作为一个植物源农药创制的新研究方向。双叶细辛作为细辛属植物中药常被用于医学研究，而在农用抑菌效果及其抑菌成分的研究鲜见报道。由致病菌引起的病害会降低农作物的产量和品质，对粮食产业造成一定的影响，因此，本研究以具有医用活性的双叶细辛为供试材料，结合当地特点，选取热带地区主要病原菌和其他作物主要病原真菌为靶标菌，以此开展双叶细辛提取物对 12 种能够引起多种植物病害、造成重大农业损失的农业病原真菌抑菌活性研究，因此本实验对热带农业常见植物病害防治具有一定意义。
试验过程中采用甲醇浸泡双叶细辛，再用石油醚、乙酸乙酯、水萃取双叶细辛甲醇提取物，对双叶细辛各相萃取物进行抑菌活性检测。研究发现，双叶细辛甲醇提取物对水稻稻瘟菌、火龙果黑斑病菌、香蕉炭疽病菌、芒果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、芒果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz)、小麦赤霉病菌、苹果轮纹病菌、番茄早疫病菌、芒果蒂腐病菌、橡胶炭疽病菌、香蕉枯萎病菌 12 种植物病原真菌菌丝生长有明显的抑制作用。结果中双叶细辛甲醇粗提物对火龙果黑斑病菌的抑制效果高于石油醚相、乙酸乙酯相和水相，可能是由于甲醇粗提物中的活性成分在萃取过程中加热挥发导致，可以进一步实验分离提取活性成分。本实验中双叶细辛甲醇提取物对病原真菌的抑制效果具有一定的广谱性，具有开发成为植物源杀菌剂的潜力。
另外，本研究发现，双叶细辛甲醇提取物和石油醚萃取相比水相、乙酸乙酯萃取相的抑菌活性好，这说明各萃取相的抑菌活性成分不同且主要抑菌活性物质在石油醚相中，可用色谱技术对其做进一步的分离，纯化出活性单体化合物，为新农药的创制提供结构新颖的先导化合物，丰富植物源天然产物农药的理论基础。研究还发现，双叶细辛提取物石油醚和乙酸乙酯萃取相 1 mg/mL 的浓度下都对香蕉炭疽病菌表现出最好的抑制效果，抑制率均达 99%以上，优于梁财等研究报道的药用植物山芝麻提取物对香蕉炭疽病菌的抑菌活性报道效果[16]，推测双叶细辛中存在对香蕉炭疽病菌具有较强抑菌活性的物质，并通过孢子萌发实验和离体实验表明双叶细辛甲醇提取物对香蕉炭疽病有一定防治效果，可以深入研究分离纯化出有活性的化合物，这一发现对将来双叶细辛开发成为防治香蕉炭疽病的植物源杀菌剂提供了一定的理论基础。本研究只对双叶细辛的抑菌活性进行了初步研究，关于双叶细辛中的抑菌活性化合物分离鉴定及其抑菌机理、作用方式等并未深入研究，并且还可以进行田间药效试验测定对农作物病害的防治效果，有望开发出高效、天然、安全的新型植物源杀菌剂。 ——论文作者：夏玉莲，曹云，伍显锋，曹凤勤，侯宗敏，董存柱
相关期刊推荐：《河北农业大学学报》(双月刊)创刊于1959年，是河北农业大学主办的综合性农业学术核心期刊(双月刊，国内外公开发行)，主要刊登农学、园艺、植物保护、林学、畜牧兽医、食品科学、农业机电工程、土木建筑工程等学科及其交叉学科的基础理论研究和应用研究方面的原创性学术论文。
