规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白基因编辑技术在感染性疾病诊断中的应用及其进展
发布时间：2021-05-27
【摘要】规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)与相关蛋白Cas(CRISPR-Cas)系统是近来的研究热点，除在基因编辑方面有重要作用外，其应用于感染性疾病诊断方面也有很好的发展前景。传统感染性疾病检测及分子检测诊断技术在操作、检测周期及敏感度、特异度等方面存在不足。随着对CRISPR-Cas系统的深入研究，针对其特异核酸的识别和遗传修饰功能，可开展对感染性病原体检测技术的应用，目前发现可应用于检测的主要有Cas9、Cas12a和Cas13核酸酶。利用该检测技术的高效性、特异性和可编程性，可开展对寨卡病毒、登革热病毒、疟疾菌株、结核分枝杆菌、人乳头瘤病毒、埃博拉病毒、乙型肝炎病毒及严重急性呼吸综合征冠状病毒2等一系列感染性疾病病原体的检测。CRISPR-Cas基因编辑技术可能成为一种快速、灵敏、特异、低廉和可靠的诊断技术，为感染性疾病的诊断提供重要的理论依据。笔者主要对Cas9、Cas12a、Cas13等在感染性疾病诊断中的应用及其进展进行综述。
【关键词】规律成簇间隔短回文重复序列;Cas蛋白;传染病;病原体;基因编辑
感染性疾病中的病原微生物种类繁多，包括各种病毒和细菌等，其变异迅速，传播广泛，严重威胁着人类健康，因此对快速鉴定感染性疾病中病原微生物的检验技术有迫切的需求。传统检测方法操作繁琐，检测周期长，且对操作人员技术水平要求较高。随着医学微生物学研究技术的不断发展，已深入到分子与基因水平[1]。除各种基于聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)的核酸检测方法外[2]，还建立了基于核酸分子杂交、恒温扩增、基因测序和生物芯片技术等一系列基因诊断检测方法，但这些方法中存在不同程度的操作技术复杂、过程繁琐、成本高、设备特殊、准确度和特异度低等问题。迫切需要开发更快速、简便、价廉的高敏感度和高特异度的新型检测技术，以实现对感染性疾病的早发现、早治疗、早控制。近年来，对规律成簇间隔短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR)相关蛋白(CRISPR-associatedproteins，Cas)系统特异核酸识别和遗传修饰等功能展开深入研究。CRISPR-Cas是利用模块化的DNA或RNA结合蛋白，通过设计包含与目标序列互补间隔物的CRISPRRNA(crRNA)或向导RNA(guideRNA，gRNA)来结合特定序列[3]。目前，CRISPR-Cas技术在感染性疾病诊断方面取得较大进展，主要有CRISPRCas9、CRISPR-Cas12a和CRISPR-Cas13，分别具有不同动力学特性，可分别对DNA和RNA实现体外核酸的快速检测。笔者就CRISPR-Cas检测技术在感染性疾病诊断中的应用及其进展做一综述。
一、CRISPR-Cas技术基本原理
CRISPR-Cas系统是存在于约48%的细菌和约80%的古细菌中的自适应免疫系统[4]，CRISPR基因座在大肠杆菌中以高度同源的重复序列呈现[5]。依据Cas基因与位点结构之间的序列相似性将CRISPR-Cas系统分为两大类[6]:第一类系统(包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型)存在于细菌和古细菌中，通常形成多亚基蛋白-crRNA效应复合物[7-8];第二类系统(包括Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ型)，依赖于一个单一的crRNA引导蛋白进行目标干扰[7，9]。
Cas9(二类Ⅱ型)为RNA引导的DNA裂解酶，对DNA的识别是由20-核苷酸向导RNA(smallguideRNA，sgRNA)序列决定。sgRNA可行使向导功能，与Cas9蛋白结合，引导Cas9酶靶向基因组DNA进行剪切，提高了其在大规模基因组操作或筛选方面的适应性[10]。Cas12a(二类Ⅴ-A型)，利用富含T碱基的原间隔序列临近基序(protospaceradjacentmotif，PAM)位点对DNA进行干扰，在单一crRNA介导下切割DNA产生5'突出黏性末端[11]。Cas12a在crRNA的介导下靶向结合双链脱氧核糖核酸(double-strandedDNA，dsDNA)后，可激活特异性dsDNA切割活性及非特异性单链脱氧核糖核酸(single-strandedDNA，ssDNA)反式裂解活性[12-13]。Cas13a(二类Ⅵ-A型)不同于其他的两类CRISPR效应蛋白，其缺少一个DNA酶的结构域，具有两个保守的高等真核生物及原核生物核酸结合功能区，该功能区使其具有了RNA酶的活性[9]。Cas13是第一个被描述用于RNA引导RNA靶向的单蛋白效应器，独特的RNA靶向机制，为RNA引导的RNA靶向研究提供了新思路[14]。
二、CRISPR-Cas检测技术在感染性疾病诊断中的应用
1.CRISPR-Cas9检测技术在感染性疾病诊断中的应用:自对化脓性链球菌Cas9进行鉴定以来，CRISPR-Cas9在感染性疾病诊断中的应用越来越多[15]。Cas9或Cas的变体可以结合和切割RNA，这一发现促进对病毒感染的诊断[16]。CRISPR-Cas生物传感系统Cas9裂解技术与核酸扩增技术相结合，检测特异的核酸序列，用于病原体的基因分型和单核苷酸多态性的识别。Pardee等[17]将恒温RNA扩增连接到支点开关RNA传感器技术上，检测临床相关的寨卡病毒序列水平证明该序列的特异性。将区分不同寨卡病毒基因型的核酸依赖性扩增检测技术(nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA)与Cas9效应器成功结合起来，从病毒性血浆中以单碱基分辨率鉴别出48种不同的寨卡病毒株并对其进行基因分型。Muller等[18]将CRISPR-Cas9与光学DNA图谱结合，鉴定细菌抗生素耐药基因。gRNA-Cas9复合物结合并裂解含有抗性基因质粒的特定核酸序列，然后将荧光染料(YOYO-1)和纺锤霉素分别选择性地结合到产生的富含A和T碱基的DNA区域，产生不同的发射强度，允许检测不同的抗性基因。利用该方法，能够区分产生不同超广谱β内酰胺酶的质粒，同时能够允许多个crRNAs加入在同一反应中检测多个抗性基因。Quan等[19]将FLASH技术与Cas9新型亚基因组下一代测序(nextgenerationsequencing，NGS)靶向富集系统结合直接适用于抗生素耐药性检测等。利用Cas9的高效性、特异性和可编程性丰富程序化序列集，对FLASH进行调整实现高水平的多路复用(数千个目标)，并且加强确认通过传统的NGS读出所固有的精度和序列标识，以在混合感染的情况下识别疟疾菌株变体。
2.CRISPR-Cas12a检测技术在感染性疾病诊断中的应用:Cas12a的显著特性使其用于目标DNA与RNA快速检测，成为CRISPR-Cas基因组编辑工具包的一个有用的补充，充实了感染性病原体快速检测的应用。Chen等[20]利用Cas12a反式激活切割活性与等温扩增相结合开发一种以DNA内切酶为靶点的CRISPR反式报告(DNAendonucleasetargetedCRISPRtransreporter，DETECTR)方法，实现了对DNA临床诊断敏感性的检测要求(amol/L级别)，从而实现了对患者样本中病毒的快速特异检测。该方法可准确地识别含有不同类型人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)混合物的患者样本中的HPV16和HPV18。Li等[21]利用Cas12a反式切割活性及淬灭荧光ssDNA报告器作为探针的荧光报告系统，开发出高敏感核酸检测方法HOLMES，用于快速检测DNA病毒(如伪狂犬病病毒)和RNA病毒(如日本脑炎病毒)，两者的敏感度可低至1～10amol/L。
He等[22]将CRISPR-Cas检测与基于荧光的护理点(afluorescence-basedpoint-of-care，POC)系统相结合建立一种高通量、全溶液阶段、等温非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)检测系统。该系统具有高敏感度和高特异度，能够在飞摩尔(fmol/L)级范围内检测ASFV，并可区分序列匹配密切的核酸靶标。同时，该系统具有一次性试剂盒和灵敏的定制荧光计，适用于低资源设置。Tao等[23]将CRISPRCas12a系统应用于切割PCR或环介导等温扩增(loopmediatedisothermalamplification，LAMP)中，同时新开发两个新的单链脱氧核糖核酸-荧光团-淬灭剂(DNA-fluorophorequencher，ssDNA-FQ)报告子，从而增加荧光信号的亮度可视化核酸检测，优化CRISPR-Cas12a系统结合核酸扩增技术，用于ASFV检测。Bai等[24]将重组酶介导等温核酸扩增技术和CRISPR-Cas12a结合建立CORDS方法检测ASFV，其对包括猪瘟在内的其他13种猪病毒均无交叉反应。
新型冠状病毒肺炎(CoronaVirusDisease2019，COVID-19)与严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2，SARS-CoV-2)感染相关，该病迅速传播，导致全球大流行[25]。Broughton等[26]报告了一种基于CRISPR-Cas12a用于从呼吸拭子RNA提取物中检测SARSCoV-2的DETECTR方法。DETECTR检测技术提供了一种可视化和快速的替代方法，可替代美国疾病控制和预防中心SARS-CoV-2实时逆转录PCR(reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)检测，具有95%阳性预测一致性和100%阴性预测一致性。Ding等[27]通过引入了一对crRNAs启动双重CRISPR-Cas12a检测并提高检测敏感度，建立了一种简便、快速、超敏感、一步法、可视化检测SARS-CoV-2和人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)的方法AIOD-CRISPR。通过检测从人血浆样品中提取的HIV-1RNA进行评估，获得与实时RT-PCR方法一致的敏感度结果。Ali等[28]将逆转录环介导等温扩增(reversetranscription-loopmediatedisothermalamplification，RT-LAMP)的强大病毒扩增能力和CRISPR-Cas12a对SARS-CoV-2的特异检测能力相结合，建立了对SARS-CoV-2检测的一个高效、快速、特异、敏感的模块，命名为iSCAN。将RT-LAMP-CRISPR-Cas12a模块与侧流细胞相结合，实现了对SARS-CoV-2的高效检测。CRISPR检测方法在病毒检测中开发较多，但在细菌中较少。Ai等[29]通过优化裂解和细胞壁破裂的条件，同时利用聚合酶介导的DNA扩增和Cas12a介导的酶信号扩增，开发了一种基于CRISPR的结核快速检测方法(CRISPR-mycobacteriumtuberculosis，CRISPR-MTB)。利用CRISPR-MTB对179例患者进行回顾性队列研究，将其与培养和利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(GeneXpertMTB/RIF)进行比较，并利用该方法对肺和肺外结核病的临床队列的诊断性能进行评估。CRISPR-MTB试验在与培养和Xpert比较中显示较高的敏感度，同时具有接近单拷贝的高敏感度，只需要较少的样本输入，并提供比Xpert更短的周转时间。在不同类型的样本中，CRISPR-MTB表现出比培养和Xpert更强的整体诊断性能，并为肺和肺外结核病的新诊断技术提供了巨大的潜力。
3.CRISPR-Cas13检测技术在感染性疾病诊断中的应用:Cas13对靶点RNA序列识别后可呈现出强大且对非特异RNA序列的“平行切割”效应[14]。East-Seletsky等[30]首次利用LbuCas13a蛋白对目标RNA的核酸进行检测，结果表明仅能对10pmol/L的RNA分子进行检测，无法达到临床诊断的检测要求。随后，Gootenberg等[31]发现检测效率更高的LwCas13a蛋白，并首次将其与重组聚合酶等温扩增技术(reconbinasepolymeraseamplification，RPA)结合，建立敏感度达单拷贝、特异性达单碱基的高敏感、高特异性核酸检测方法SHERLOCK。该系统可用于生物样本(血液或尿液)中寨卡以及登革热病毒的检测，并且可以进一步区分其特定型别(如非洲寨卡和美洲寨卡)，鉴定病原菌以及人体内游离的突变肿瘤DNA。Myhrvold等[32]开发出一种与SHERLOCK配对可直接从体液中检测病毒的HUDSON技术，可以在2h内从患者的全血、血清和唾液样本中高度敏感地检测出登革热病毒，同时可区分4种登革热病毒血清型，以及2015至2016年流行的寨卡病毒区域特异株。Wu等[33]利用Cas13进行血浆EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)-DNA的室温检测，对EBV相关疾病的筛查和监测具有重要的临床和研究价值。改进后的室温SHERLOCK平台，有助于在生物技术和感染性疾病诊断中等一系列应用中检测核酸的存在。
Qin等[34]将自动化和多路复用CRISPR微流控芯片与定制设计的台式荧光计结合，用于快速和低容量(～10μL)埃博拉病毒检测。使用该集成系统，可通过编程与不同RNA靶点互补的crRNA间隔序列实现对任何病毒RNA的临床诊断。Barnes等[35]基于SHERLOCK诊断方法同时使用荧光和横向流量读数，针对埃博拉病毒和拉萨热病毒，在实验室和临床样本上证明检测方法的敏感度及特异度。同时开发HandLens报告结果，方便SHERLOCK在地方病地区的使用。
相关期刊推荐：《现代诊断与治疗》是我国生态学领域创刊最早的专业性学术刊物。本刊以发挥其在植物生态学领域的导向性、权威性和科学性为指导思想，突出反映植物生态学科热点和生长点的研究成果。辟有专家论坛、中外医学交流、现代临床医学在中国、华夏医学掠影、论著、诊疗新技术、综述、药物与临床、教学查房及基层医生进修园地等十余个栏目。
Wang等[36]用基于PCR和CRISPR-Cas13a检测系统建立了一种高度敏感和实用的乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)和耐药性的PCR-CRISPR检测方法，其中302份样本与qPCR结果一致，其余10份HBVDNA水平较低的样本可用PCR-CRISPR和微滴式数字PCR(dropletdigitalPCR，ddPCR)检测到;PCR-CRISPR对经酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸检测qPCR试剂盒和直接测序检测到的所有412个耐药样本，以及qPCR和直接测序检测不到的其他12个低水平HBVDNA耐药样本进行诊断。PCR-CRISPR检测方法在HBV感染的早期检测、耐药性监测和治疗指导方面具有广阔的应用前景。Liu等[37]利用Cas13a通过与H1N1和H5N1等亚型病毒的比较，成功建立了基于CRISPR-Cas13a纳米机器H7N9的快速检测方法，实现了对H7N9的快速、特异检测。COVID-19的大流行，强调新的诊断技术对于控制疾病·46·中华诊断学电子杂志2021年2月第9卷第1期ChinJDiagnostics(ElectronicEdition)，February2021，Vol.9，No.1传播至关重要。Arizti-Sanz等[38]将SHERLOCK的步骤合并为一步反应，并优化HUDSON以加速鼻咽拭子和唾液中的病毒失活以此开发出SHINE(SHERLOCKandHUDSONIntegrationtoNavigateEpidemics)，可从未提取的样本中检测出SARS-CoV-2RNA。在50份鼻咽拭子样本上验证SHINE，结果与RT-PCR比较，SHINE的敏感度和特异度分别为90%和100%。SHINE有可能在医院和临床实验室之外使用，大大提高诊断能力。Patchsung等[39]利用SHERLOCK进行检测并分析采集的154个感染SARS-CoV-2的鼻咽和咽喉拭子临床样本。在每反应42个RNA拷贝的检测限内，SHERLOCK用荧光读数法的特异度和敏感度均为100%，而用横向流量读数法的特异度和敏感度分别为100%和97%。对于临床样本中的全部病毒载量，荧光读数具有100%的特异度和96%的敏感度。对于380例手术患者术前SARS-CoV-2阴性标本，SHERLOCK与逆转录定量PCR检测结果100%一致，证明该方法可在单一的横向流动条中进行多重检测，并对核糖核酸酶污染进行内部控制，这有助于在资源有限的环境中检测SARS-CoV-2。Ackerman等[40]开发一个可扩展的、多重病原体检测的平台CARMEN(combinatorialarrayedreactionsformultiplexedevaluationofnucleicacids)。CARMEN和Cas13检测(CARMEN-Cas13)结合使用，可在单个阵列上对超过4500个crRNA目标对进行可靠地测试，可同时区分所有169种已发表基因组序列的人类相关病毒，同时也可用于检测COVID-19大流行的病原体。CARMEN-Cas13进一步实现了对甲型流感病毒株的全面分型和对数十种HIV耐药突变的多重鉴定。
三、结语与展望
CRISPR技术打破了传统诊断技术的局限性，正在创造出低成本、高敏感度、高特异度的分子诊断技术。目前在广泛使用Ⅱ型CRISPR-Cas系统的情况下，基于CRISPR-Cas9检测技术开发出来的NASBA及FLASH检测方法可实现对寨卡病毒及疟疾菌株的高效性和特异性检测。基于CRISPR-Cas12a检测技术开发出来的DETECTR、HOLMES、CORDS、iSCAN、AIOD-CRISPR及CRISPR-MTB等检测方法，分别可对不同类型HPV、伪狂犬病毒、乙型脑炎病毒、ASFV、SARS-CoV-2、HIV和结核分枝杆菌等病原体实现高敏感性和高特异性的快速检测。基于CRISPR-Cas13检测技术开发出来的SHERLOCK、HUDSON、HandLens、PCR-CRISPR、SHINE及CARMEN等检测方法，分别可对寨卡病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、拉萨热病毒、HBV及SARS-CoV-2等病原体实现高敏感度和高特异度的快速检测。近年来，利用Cas12a、Cas13b和Csm6对SHERLOCK进行改进，使其能够在同一反应中处理多个核酸样本，很大程度上提高了敏感度和简单性，形成了SHERLOCKversion2(SHERLOCKv2)检测系统[41]。
综上所述，利用基于CRISPR-Cas系统对特异核酸的识别和遗传修饰功能，可以开展对病原体的快速检测。近年来，基于CRISPR-Cas的诊断平台已显示出理想的感染性疾病病原体检测性能，其操作简便，成功率及效率高，可实现快速、灵敏、特异、低廉和可靠的诊断。基于CRISPR的可扩展、高度复用的核酸检测，将诊断和监测工作从高优先级样本的定向检测转移到大样本集的综合检测，有望在世界上几乎任何地方实施，以实现对病毒感染的有效、快速诊断，极大地造福患者和公众健康，使之有可能成为疫情暴发时病原体检测的前沿工具，其未来有可能发展成为一种强大而高效的感染性疾病快速检测方法。——论文作者：于佳佳1张旭霞1李传友1刘毅1唐神结2
