软枣猕猴桃菌核病病菌生物学特性及药剂防治研究
发布时间：2021-05-18
摘要：本研究运用组织分离法从软枣猕猴桃患病根部分离获得了10个具有致病性的菌株。通过形态学和分子生物学鉴定，确定病原菌为Sclerotinianivalis(核盘菌)。对Sclerotinianivalis进行生物学特性和药剂敏感性的研究。研究结果显示，病菌菌丝最适生长温度为20℃;PSA为最适菌丝生长的培养基;适宜菌丝生长的最佳碳、氮源分别为葡萄糖和蛋白胨;pH值为6.0时最适菌丝生长;全光照条件利于菌丝生长。采用生长速率法测定了病菌对8种杀菌剂的敏感性。结果表明，该病原菌对25%咪鲜胺EC、50%腐霉利WP、25g/L咯菌腈SC、50%异菌脲SC、45%菌核净WP敏感性较高，其EC50<1.0mg/L。本文首次对Sclerotinianivalis进行生物学及药剂敏感性测定，对田间软枣猕猴桃菌核病的防治奠定了基础。
关键词：软枣猕猴桃;Sclerotinianivalis;病原鉴定;生物学特性;药剂敏感性
软枣猕猴桃(Actinidiaarguta)，又名软枣子，果实富含大量维生素C、各种糖类及黄酮类，营养价值很高，口感好[1]。在辽宁省东部林区大量分布。近年来，由于软枣猕猴桃作为水果备受消费者欢迎，市场需求量达，已成为人工驯化培植的优秀野生水果品种，实现了规模化种植生产[2]。伴随着软枣猕猴桃的产量化种植，病害的发生也随之增多。2002年，赵淑兰发表了关于软枣猕猴桃品种简介，介绍了魁绿、丰绿等品种并着重介绍了人工培育的新品种，扩大了软枣猕猴桃的种植规模[3]。2009年RomanazziG在猕猴桃果实上发现了灰色霉层，后鉴定为Botrytiscinerea引起的猕猴桃果实灰霉病[4]。2016年WangC等在吉林省发现猕猴桃的基部茎发生菌核病，经鉴定病原菌为Sclerotinianivalis.[5]。2017年DengJC等在吉林省白山市发现猕猴桃成熟叶片上出现炭疽症状，经鉴定病原菌为Colletotrichumgloeosporioides(胶孢炭疽菌)[6]。2017年4月在吉林省靖宇县发现软枣猕猴桃发生大量烂根死亡现象。受害植株根部着生大量白色菌丝，导致韧皮部腐烂，后期病灶周围菌丝纠结产生大量黑色菌核，病害严重时导致植株的死亡，对靖宇县猕猴桃产业造成较大影响。本研究旨在对该病害进行病原鉴定，并研究其生物学特性和药剂敏感性，为该类病害的预防、治疗提供理论与实践依据。
1试验材料和方法
1.1病害标本的采集及症状观察
2017年4月，在吉林省靖宇县种植基地内发现该病害，记录病害症状、发病程度并拍照保存[7]。
1.2病原菌的分离
1.2.1病菌的分离
用已灭菌的挑针挑取根部发病部位的白色菌丝，置于PDA培养基上，每皿放3块于25℃恒温培养[8]。
1.2.2分离物的纯化
取已灭菌的接种铲，挑取菌落边沿的单根菌丝尖端2〜3mm，置PDA平板培养基中，25℃培养。
1.3柯氏验证
1.3.1致病性测定
将每一个菌株置于PDA上，25℃培养箱中，培育7d备用。选用健康的软枣猕猴桃幼苗，根部用75%的酒精擦拭，将打取的直径8mm菌饼贴敷于植株根部，用无菌水浸湿的无菌棉进行保湿，并对健康的软枣猕猴桃幼苗根部做接种空白PDA培养基为对照，保湿72h。观察试验组与对照组发病情况并拍照记录。
1.3.2再分离
将接种后发病的植株采用组织分离法再分离，将再分离得到的菌株与所接种的菌进行对比，以确定所得菌株为致病菌。
1.4病原菌的形态特征观察
观察PDA培养基上病原菌的菌落形态、色彩、质地及生长状态，做好详细的记录并拍照。查阅《中国真菌志》等相关资料进行初步鉴定[9]。
1.5病原菌的分子生物学鉴定
1.5.1真菌DNA的提取采用CTAB法进行菌株DNA的提取[10]，备用。
1.5.2PCR的扩增
以菌株RZ1基因组为模版，以ITS4与ITS5为引物(ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’/ITS5:5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)，对病菌ITS区域进行PCR扩增。
反应系统为25μL：10×PCRBuffer为2.5μL，25mmol/LMgCl2加1μL，10mmol/LdNTP加2.5μL，5u/μLTaqDNA酶加1μL，模板DNA加1μL，无菌双蒸水补足;PCR反应需求为：94℃预变5min，94℃变性1min，48.5℃退火50s，72℃延伸1min共35个循环，72℃温浴10min，4℃保留。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，而后，将电泳产品送至相干公司测序。
1.5.3序列的分析比对
将测得序列rDNA-ITS与GenBank核酸数据库中的相关序列进行同源性比对，并查阅相关文献，完成对病原菌的鉴定。
1.6病原菌生物学特性测定
供试菌株：RZ1
1.6.1不同培养基对病菌生长的影响
选用PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)、PSA(马铃薯蔗糖琼脂培养基)、PCA(马铃薯胡萝卜琼脂培养基)、CA(胡萝卜琼脂培养基)、CMA(玉米粉琼脂培养基)和WA(水琼脂培养基)。放置直径为8mm菌饼到上述各已凝固培养基中，每个平板加入15mL定量培养基，该处理重复3次，25℃恒温培育3d，然后用十字交叉法去测量菌落直径，下同[11]。
(1)PDA：133g新鲜去皮马铃薯，12g葡萄糖，8g琼脂粉，666mL蒸馏水
(2)PSA：133g新鲜去皮马铃薯，12g蔗糖，9g琼脂粉，666mL蒸馏水
(3)PCA：13g新鲜去皮马铃薯，8g新鲜去皮胡萝卜，8g琼脂粉，666mL蒸馏水
(4)CA：66g新鲜去皮胡萝卜，13g琼脂粉，666mL蒸馏水
(5)CMA：26g新鲜现磨玉米粉，13g琼脂粉，666mL蒸馏水
(6)WA：10g琼脂粉，666mL蒸馏水
1.6.2不同碳源对病菌生长的影响
基础培养基选用查氏培养基，分别称取种类不同但相等质量的碳源，分别是果糖、乳糖、淀粉、木糖醇、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、麦芽糖代替查氏培养基中的蔗糖，每皿定量15mL培养基，重复3次。待培养基凝固后，将直径为8mm菌饼用接种铲放入平板中25℃恒温培养3d，然后再采用十字交叉法去测量菌落直径。
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查氏培养基：30g蔗糖，3gNaNO3，1gK2PO4，0.5gMgSO4·7H2O，0.5gKCl，0.01gFeSO4·7H2O，20g琼脂粉，1000mL蒸馏水，pH7.0〜7.2。
1.6.3不同氮源对病菌生长的影响
基础培养基选用查氏培养基，分别称取不同等质量氮源，分别是硝酸铵、蛋白胨、硝酸钾、L丙氨酸、甘氨酸、氯化铵、硝酸钠、天冬酰胺代替查氏培养基中的硝酸钠，每皿定量15mL，重复3次。待培养基凝固将直径为8mm菌饼放入平板中25℃恒温培养3d后，用十字交叉法测量菌落直径。
1.6.4不同光照对病菌生长的影响
将直径为8mm菌饼放置于PDA培养基平板中心，设定完全黑暗、光暗交替(半光照)和持续光照3个光照条件，并在25℃恒温培养3d后，用十字交叉法测量菌落直径。
1.6.5不同温度对病菌生长的影响
将平板内加入15mLPDA培养基并将直径为8mm菌饼移到培养基中央，将平板分别放在5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃六种温度条件下恒温培养，重复3次，3d后测量菌落直径(十字交叉法)。
1.6.6不同pH对病菌生长的影响
用浓度为1mol/L的HCl溶液和NaOH溶液调试已灭菌PDA的pH，将pH分别调为10.0、9.0、8.0、7.0、6.0、5.0和4.0，将直径为8mm的菌饼分别放置到不同pH值的PDA平板中，重复3次，25℃恒温培育3d后，用十字交叉法测量菌落直径。
1.7室内药剂敏感性测定
1.7.1供试菌株及药剂
供试菌株为RZ1
供试药剂的名称含量、剂型及生产单位如下：50%腐霉利WP(河北中天邦正生物科技股份公司)，45%菌核净WP(江西禾益化工股份有限公司)，80%甲基硫菌灵WDG(江苏龙灯化学有限公司)，25g/L咯菌腈SC(先正达南通作物保护有限公司)，25%咪鲜胺EC(江苏辉丰农化股份有限公司)，50%异菌脲SC(江门市大光明农化新会有限公司)，50%福美双WP(天津市捷康化学品有限公司)，25%嘧菌酯SC(海利尔药业集团股份有限公司)。
1.7.2试验方法
采用生长速率法，比较菌株在不同混药平板中菌丝生长状况。首先将27mL.PDA培养基置于50mL三角瓶中，灭菌。将不同药剂配置成1×103mg/L、1×102mg/L、1×101mg/L、1mg/L、1×10-1mg/L、1×10-2mg/L6个浓度。每种药剂分别取3mL加到PDA中，充分混匀配置成混药平板，重复2次。以加入等体积无菌水的PDA平板为对照。将直径8mm菌饼菌丝面朝下放在平板中，25℃恒温培养3d后，测量菌落直径(十字交叉法)[12-14]。
2结果与分析
2.1病害症状
病原菌主要危害根部，根部上长满白色菌丝，菌丝上附着黑色菌核，湿腐，田间大面积发生，导致苗期植株无法继续生长(图1)。
2.2病原菌分离结果
通过组织分离获得10个菌株，RZ1、RZ2、RZ3、RZ4、RZ5、RZ6、RZ7、RZ8、RZ9、RZ10。
2.3病原菌致病性测定及分离物的再分离结果
采用菌饼接种法接种健康的软枣猕猴桃幼苗根部，接种15d后幼苗根部表面出现白色菌丝，20d后菌丝上附着黑色菌核，与田间症状基本一致，而对照组幼苗根部未发病。从发病部位挑取菌丝进行病菌的再分离，而后比较再分离得到的病原菌与田间发病幼苗根部上分离得到的病原菌相一致，证明组织分离得到的10个菌株具有致病力，且为该病害的致病菌。
2.4病原菌的培养性状及形态观察结果
病原菌在PDA培养基20℃条件下培养3d直径45〜55mm。菌落近圆形，白色菌丝生长迅速，15d后菌落逐渐变黑，并在菌落中心周围长出黑色菌核，菌核形状不规则且较硬(图2)。
2.5病原菌分子生物学鉴定结果
选取真菌通用性引物ITS4/ITS5对代表菌株RZ-1进行PCR扩增。PCR产物经生物公司测定后，将所得序列与GenBank中已发表序列分析对比，发现该病菌的ITS序列与Sclerotinianivalis(AccessionNo.AB516670.1)的同源性为100%。根据其形态学和ITS分析结果，参考相关文献[15-16]，鉴定软枣猕猴桃菌核病致病菌为：Sclerotinianivalis(图3)。
2.6病原菌生物学特性测定
2.6.1不同培养基对病菌生长的影响
S.nivalis在这6种培养基上均能生长。在PDA和PSA上生长迅速，与其他培养基差别较大，其中在PSA上生长速率最高，在水琼脂培养基上菌丝生长最慢(图4)。
2.6.2不同碳源对病菌生长的影响
S.nivalis在供试8种不同碳源条件下均能生长且差异不显著，以甘露醇、果糖为碳源的培养基中生长迅速，其中以葡萄糖为碳源的培养基上长势最佳(图5)。
2.6.3不同氮源对病菌生长的影响
S.nivalis在这8种不同氮源条件下均能生长，在以硝酸钠、硝酸钾和蛋白胨为氮源的培养基中生长迅速，其中在以蛋白胨为氮源的培养基中长势最佳，含甘氨酸的培养基中S.nivalis菌丝生长最慢(图6)。
2.6.4不同光照对病菌生长的影响
S.nivalis在3种不同光照中均能迅速生长，在全光照下生长速率最高，全黑暗下S.nivalis生长最迟缓(图7)。
2.6.5不同温度对病菌生长的影响
在不同温度条件下S.nivalis在PDA培养基中生长速度差异较大，其中适合S.nivalis生长温度为20℃左右，最佳温度为20℃(图8)。
2.6.6不同pH对病菌生长的影响
S.nivalis菌丝在pH4-10的PDA培养基中均能生长，pH5〜7适宜S.nivalis菌丝生长，pH=6最适合S.nivalis菌丝生长，碱性环境不利于菌丝生长(图9)[15-16]。
2.7室内药剂敏感性测定结果
由表1可知，软枣猕猴桃根腐病对所选的8种杀菌剂均有敏感性。S.nivalis对8种杀菌剂敏感性为：25%咪鲜胺EC、50%腐霉利WP、25g/L咯菌腈SC、50%异菌脲SC、45%菌核净WP、80%甲基硫菌灵WDG、25%嘧菌酯SC、50%福美双WP，软枣猕猴桃根腐病菌丝生长对8种杀菌剂敏感性最好的是25%咪鲜胺EC，其次为50%腐霉利WP、25g/L咯菌腈SC[17-18]。
3结论与讨论
本试验对软枣猕猴桃菌核病的症状进行了描述，对病菌进行了分离纯化及致病性测定，再分离证实所获得的分离物RZ1、RZ2、RZ3、RZ4、RZ5、RZ6、RZ7、RZ8、RZ9、RZ10为该病害的病原菌。结合其形态特征和分子生物学鉴定结果，确定致病菌为Sclerotinianivalis。
试验中选出适宜病原菌生长的生物学条件如下：PSA和PDA培养基较适合菌丝生长;葡萄糖、果糖为较佳碳源;氮源为硝酸钾、蛋白胨;最佳pH为6;培养温度为20℃及全光照环境下培养菌丝生长速率最快。
在供试的8种药剂中，病菌菌丝生长对25%咪鲜胺EC敏感性较高EC50为0.00848mg/L，其次为50%腐霉利WP、25g/L咯菌腈SC，EC50分别为0.08951mg/L，0.10563mg/L。
本文提出了由Sclerotinianivalis引起的软枣猕猴桃菌核病，描述了病原菌在植物根部上表现出的致病症状，以便于在种植中，辨识此病害并及时进行防护奠定了基础;首次对病原菌生物学特性进行研究，了解到对其具有有利与不利作用的各种营养和环境条件，并在室内药剂敏感性测定中筛选出敏感性较高的药剂，可供大田实验和实际生产做用药参考。
本文对其生物学特性进行了初步的研究并筛选出了几种常见且有明显抑制效果的化学药剂，但田间防治效果还有待讨论，所以此方面还有待探究。——论文作者：孙东晗林碧蓉白小隆王晓梅*白庆荣*
