Gitelman综合征患者的遗传学研究
发布时间：2021-04-25
【摘要】目的筛查Gitelman综合征(Gitelmansyndrome，GS)患者的致病基因。方法纳入2015年1月—2020年12月在四川大学华西医院内分泌代谢科诊治的GS患者及其家系成员，采用二代测序联合一代验证方法筛查致病基因。结果共纳入15例GS患者。所有患者行基因分析均提示SLC12A3基因突变，其中复合杂合突变9例，杂合突变6例。共发现12个已报道的致病位点和8个新的致病突变。新发现致病突变中，4个为错义突变(分别是c.539C>A,p.T180K、c.1077C>G,p.N359K、c.1967C>T,p.P656L、c.2963T>C,p.I988T)，1个为单个碱基缺失所致框移突变(c.2543delA,p.D848fs)，1个为无义突变(c.2129C>A,p.S710X)，1个为大片段缺失(外显子7-8部分编码序列缺失)，1个为编码序列的缺失和异常碱基序列插入(IVS7-1至C.976缺失GCGGACATTTTTG插入ACCGAAAATTTT)。结论该研究发现8个导致GS的新基因突变，其确切致病机制有待后续研究进一步证实。
【关键词】Gitelman综合征;低血钾;低血镁
Gitelman综合征(Gitelmansyndrome，GS)为基因突变导致的常染色体隐性遗传性疾病，主要临床表现是持续性低血钾，且多为中重度低血钾，反复出现乏力、心悸等症状，增加了猝死风险[1-2]，尤其合并甲状腺疾病时，低钾症状更明显[3-4]。GS的病因为SLC12A3基因突变，导致远曲小管钠-氯协同转运体通道蛋白功能障碍，从而导致远曲小管对钠、氯的重吸收减少，而机体为了维持正常的钠、氯水平，使远曲小管及集合管的钠离子与氢离子、钠离子与钾离子交换增加，就形成了临床上典型的低血钾、高尿钾、代谢性碱中毒表现。由于机体内电解质及水的丢失过多，使血容量减少，继而激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensinaldosteronesystem，RAAS)，临床就表现为典型的继发性醛固酮增多，但此类患者血压通常不高。
目前国际上已有超过488种关于GS的基因突变报道，但国内文献报道的仅有80种左右，中国人群突变热点区域在T60M和D486N，常见突变类型为复合杂合突变[5-6]。为更进一步了解GS的临床特点与基因突变类型，本研究纳入了GS患者及其家系成员，通过二代测序技术筛查进一步了解GS潜在的致病基因。现报告如下。
1资料与方法
1.1研究对象
选择2015年1月—2020年12月在四川大学华西医院内分泌代谢科住院诊治，临床及基因检查确诊为GS的患者。纳入标准(全部满足)：患者同时有低钾血症、尿钾排出增多(24h尿钾>25mmoL)，合并代谢性碱中毒，血浆肾素活性、醛固酮浓度、血管紧张素浓度增高。排除标准(满足其一)：①临床诊断GS，但拒绝送检基因筛查者;②患有高血压。本研究已通过四川大学华西医院生物医学伦理委员会审查，审批号：2019年审(556)号。
1.2研究方法
1.2.1生物化学及基因检查 ①收集所有临床诊断GS患者入院时的尿常规、血清肌酐、估算肾小球滤过率、促甲状腺激素(thyroidstimulatinghormone，TSH)、游离甲状腺素(freethyroxine，FT4)、同步血尿电解质、血气分析、醛固酮、血浆肾素活性、血管紧张素Ⅱ，以及氢氯噻嗪/呋塞米试验结果。
②收集GS患者的外周血，并收集患者父母的外周血或指甲/趾甲;从外周血或指甲/趾甲中提取DNA，采用二代测序的方法对先证者进行全外显子的筛查，使用一代测序对先证者及核心家系成员验证筛查出的潜在突变(北京智因公司)。
1.2.2观察指标 包括患者的性别、年龄、血压、身高、体重、体质量指数(bodymassindex，BMI)、病程、血钾、血镁、血钙、同步24h尿钾及尿钙、尿钙/尿肌酐、醛固酮、血浆肾素活性、血管紧张素Ⅱ、氢氯噻嗪/呋塞米试验、血清肌酐、估算肾小球滤过率、TSH、FT4、空腹血糖、肝功能。出院后门诊或电话随访患者的血钾、血镁水平。患者血钾>3.0mmol/L、血镁>0.6mmol/L，提示治疗达标[7]。
开展氢氯噻嗪/呋塞米试验(试验结果以文献[8]为参考)以进一步明确GS患者的肾小管功能改变情况。因试验需要，将诊断GS的患者作为GS组，同时纳入其他病因的低钾血症患者作为对照组。对照组纳入标准：患者同时有低钾血症、尿钾排出增多(24h尿钾>25mmoL);排除标准(满足其一)：估算肾小球滤过率<60mL/(min·1.73m2)，合并心肺功能不全，正在口服利尿剂。
1.3统计学方法
采用Excel2010数据整理及表格制作。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，非正态分布的计量资料采用中位数(下四分位数，上四分位数)表示;计数资料采用例数和百分比表示。
2结果
2.1一般临床特征
共纳入15例GS患者，男女性别比例6∶9;平均年龄为(31.2±10.1)岁，平均BMI为(20.3±2.4)kg/m2，平均收缩压为(115±11)mmHg(1mmHg=0.133kPa)，平均舒张压为(74±8)mmHg。其中，男6例，年龄14～52岁，平均(32.0±14.8)岁;病程3d～29年，中位时间为4.5(0.4，11.8)年;女9例，年龄24～44岁，平均(30.8±6.6)岁;病程年1～14年，中位时间为4.0(2.0，8.5)年。
15例GS患者均以“低钾血症原因待查”收治入院，主要临床表现为：乏力[9例(60.0%)]、心悸[5例(33.3%)]、肢体麻木[4例(26.7%)]和双手震颤[2例(13.3%)]，同时出现多汗、胸闷、气紧1例(6.7%)，见表1;6例(患者1、2、3、5、6、8)进行了先证者及其父母突变基因筛查，9例(患者4、7、9、10、11、12、13、14、15)因父母在外地或去世不能采集标本，仅进行了先证者基因筛查。
2.2实验室检查结果
15例GS患者的平均血钾为(2.76±0.43)mmol/L(参考值3.5～5.3mmol/L)，并伴有尿钾排泄明显增多，均>30mmol/24h，平均(76.43±51.47)mmol/24h(参考值25～100mmol/24h);9例存在低镁血症，平均血镁(0.66±0.17)mmol/L(参考值0.78～1.28mmol/L);10例合并代谢性碱中毒，平均动脉血气分析pH值为7.45±0.26(参考值7.35～7.45)。RAAS：14例肾素活性>12ng/(mL·h)，1例肾素活性为66.25ng/(mL·h);醛固酮浓度平均(23.43±7.99)ng/dL(参考值4.5～17.5ng/dL);血管紧张素Ⅱ平均浓度为(174.77±121.61)ng/L(参考值28.2～52.2ng/L)。TSH平均浓度为2.62(1.99，4.37)mU/L(参考值0.27～4.20mU/L)，FT4平均浓度为(18.03±3.25)pmol/L(参考值12～22pmol/L)，见表2。15例GS患者空腹血糖、肝功能、血清肌酐、估算肾小球滤过率、血钠、血氯均正常;7例合并甲状腺功能异常，但其低血钾的症状较甲状腺功能正常患者均无明显加重。
因氢氯噻嗪/呋塞米试验流程复杂，且有加重低钾血症风险，15例GS患者中仅2例配合进行，其他病因的低钾血症患者仅4例配合完成，结果提示其他病因的低钾血症患者对呋塞米有良好反应，对氢氯噻嗪反应稍弱，2例GS患者对呋塞米有良好反应，对氢氯噻嗪反应明显减弱。具体表现为：GS患者进行呋塞米试验时，氯离子清除率较未口服呋塞米前平均升高约234.8%(参考值>223%);进行氢氯噻嗪试验时，氯离子清除率较未口服氢氯噻嗪前平均升高仅12.5%。4例其他低钾血症患者，进行呋塞米试验时，氯离子清除率较未口服呋塞米前平均升高约228.6%;进行氢氯噻嗪试验时，氯离子清除率较未口服氢氯噻嗪前平均升高113.5%。
2.3治疗及疗效随访
15例GS患者入院后主要给予氯化钾口服药液或缓释片补充治疗(6～9g/d)，其中2例联合补充镁剂。治疗后，15例患者血清钾浓度升至3.0mmol/L，临床症状明显改善，但出院后仍反复出现乏力等低血钾症状，尤以夏季为甚，复查血钾多在2.6～3.2mmol/L，2例患者补镁后血镁升至0.6mmol/L。
2.4SLC12A3基因突变
15例GS患者中，6例杂合突变(患者1、2、3、4、6、11)，9例复合杂合突变(患者5、7、8、9、10、12、13、14、15)。基因突变类型包括错义突变20个(83.3%)、无义突变1个、单碱基缺失突变1个、缺失加插入突变1个和大片段基因缺失1个。其中8个基因突变既往未曾报道，包括4个错义突变(c.539C>A/外显子4、c.1077C>G/外显子8、c.1967C>T/外显子16、c.2963T>C/外显子26)、1个无义突变(c.2129C>A/外显子17)、1个单个碱基缺失致框移突变(c.2543delA/外显子21)、1个编码序列的缺失和异常碱基序列插入(IVS7-1至C.976缺失GCGGACATTTTTG插入ACCGAAAATTTT)和1个大片段缺失(外显子7-8部分编码序列缺失)。见表3。
3讨论
本研究纳入的15例GS患者的临床表现与既往文献报道疾病一致[5,9-14]。所有患者均有低血钾，RAAS激活，但血压正常;其中2例进行了氢氯噻嗪/呋塞米试验，均对呋塞米有反应，对氢氯噻嗪无反应。目前已报道的文献中，发现大约有90%的患者存在低尿钙，70%左右的患者存在低血镁[4-5]，但低尿钙及低血镁的机制尚不明确。本研究结果也显示，并非所有的患者均有低血镁，有6例血镁≥0.7mmol/L;14例24h尿钙<2.5mmol/24h，1例为5.21mmol/24h，测定了尿钙/尿肌酐的11例中，10例比值<0.2，1例为0.49，其尿钙排泄特点与2016年改善全球肾脏病预后组织会议共识对GS患者疾病特征描述相符[7]。
在本研究中，临床诊断GS的15例患者基因检测均发现SLC12A3基因失活突变。6例患者行家系检查，患者1、2、6的致病突变来自于父亲;患者3的致病突变来自母亲;患者5、8为复合杂合突变，其父母各携带一个突变。已报到的突变类型包括错义突变、缺失突变、无义突变、移码突变等，其中错义突变最常见，占60%以上，突变位点遍及整个转运体蛋白，至今已报道488余个上述类型的GS致病突变位点[4]，而本研究中错义突变占83.3%。
文献报道中亚裔人群以c.179C>T突变多见，中国人群中c.1456G>A突变也较多[5-6]。在本研究中，12个为已报道的突变位点，2例c.179C>T突变，3例c.1456G>A突变，符合主要的突变趋势;另外10个突变位点分别是c.1664C>T、c.536T>A、c.634G>A、c.658G>A、c.911C>T、c.961C>T、c.1000C>T、c.2099T>C、c.2186G>T和c.2671C>G，均有文献报道为致病突变[5,7,9-14]。
本研究发现8个尚未被报道的新致病突变，其中4个为错义突变(c.539C>A,p.T180K、c.1077C>G,p.N359K、c.1967C>T,p.P656L、c.2963T>C,p.I988T)，1个为无义突变(c.2129C>A,p.S710X)，1个为单碱基缺失导致的框移突变(c.2543delA,p.D848fs)，1个为缺失和插入共存所致框移突变(IVS7-1至C.976缺失GCGGACATTTTG插入ACCGAAAATTTT)，1个为大片段基因缺失(外显子7-8缺失)。
在这8个新发现的致病基因突变中，错义突变c.2963T>C,p.I988T与大片段基因缺失(外显子7-8缺失)共存在于患者5，位于26号外显子，为复合杂合突变，行家系遗传筛查提示患者父母各携带1个突变基因。错义突变c.1967C>T,p.P656L位于16号外显子，分别与已报道的位于12号外显子的热点突变c.1456G>A,p.D486N和位于1号外显子的c.179C>T,p.T60M共存于患者8、10，均为复合杂合突变，患者8做了家系遗传筛查，父母各携带1个突变基因。位于8号外显子的错义突变c.1077C>G,p.N359K和位于17号外显子的无义突变c.2129C>A,p.S710X共存于患者13，为复合杂合突变致病。单碱基缺失导致的框移突变c.2543delA,p.D848fs位于12号外显子，与已报道的致病基因突变c.658G>A,p.G220S共存于患者9，也为复合杂合突变致病。以上致病突变均为复合杂合突变，符合常染色体隐性遗传性疾病复合杂合突变发病的特点，因此考虑为致病性突变。因大片段基因缺失(外显子7-8缺失)、无义突变(c.2129C>A,p.S710X)及单碱基缺失导致的框移突变(c.2543delA,p.D848fs)均有巨大的生物学危害，故考虑三者均为致病突变。错义突变c.539C>A,p.T180K位于4号外显子，引起的氨基酸突变类型包含在OMIM数据库(在线人类孟德尔遗传)收录的致病突变中，考虑为致病突变，并且与已报道的位于13号外显子的c.1664C>T,p.S555L共存于患者12，也符合常染色体隐性遗传性疾病复合杂合突变致病的特点。1个缺失和插入共存所致框移突变(IVS7-1至c.976缺失GCGGACATTTTG插入ACCGAAAATTTT)存在于患者1，为杂合突变，行家系遗传筛查，提示突变来自于父亲，其父亲也患有低钾血症，该突变明显可引起氨基酸序列发生变化，有巨大的生物学危害，根据美国大学医学遗传学(ACMG)指南推测为致病突变基因[15]。
本研究的不足之处：①标本量相对较小。但GS为罕见病，本研究共纳入了15例GS患者，样本量多于大部分已发表文献的样本量，且目前鲜有我国西南地区人群中GS遗传学研究的报道，故本研究结果可提供一定GS患者的基因突变信息;②对新发现的基因突变位点未进行功能学研究，仅通过遗传学分析或软件预测了突变可能对通道蛋白功能的影响，其中3个为生物学危害巨大的插入或缺失导致的移码突变，但其他突变仍不能完全排除所发现新突变为多态性的可能。
综上，本研究发现8个导致GS综合征的新基因突变，为其遗传特征提供了基因突变类型补充信息。新突变的确切致病机制有待后续研究进一步证实。——论文作者：孙易红1,2，王晓书2，任艳1，卢春燕1，田浩明1，陈涛1
相关期刊推荐：《华西医学》是由中华人民共和国教育部主管、四川大学华西医院主办的综合性医学学术刊物。主要刊登医学专业和相关学科的临床研究成果，以及与临床联系紧密的基础研究、实验研究成果与进展。特色栏目“循证医学”，反映国内外循证医学和临床流行病学研究进展，对诊疗技术、临床药物的系统评价，对临床医学文献的综述及系统评价等。
