非动物源蛋白胨对兽疫链球菌产透明质酸影响的研究
发布时间：2020-06-30
摘要：本研究对比了几种不同的非动物源蛋白胨和动物源蛋白胨对兽疫链球菌产透明质酸的影响。采用3L六联发酵罐培养，对4种非动物源蛋白胨及2种动物源蛋白胨进行了对比研究。结果表明，非动物源蛋白胨FP501能很好的对生产用的牛骨胨进行替换，发酵18h，透明质酸产率能达到9.55g/L，优于现在生产用的骨胨。
关键词：兽疫链球菌;透明质酸;非动物源蛋白胨;酵母蛋白胨
透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是由N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸组成的一种高分子多糖，其具有高度的粘弹性、可塑性、渗透性和良好的生物相容性。HA的分子量决定了其在不同的应用领域发挥效力，如低分子量HA(Mr<1×106Da)被证明在促血管生成、逆转肿瘤耐药、保护骨关节等方面具有广阔的应用前景[1-3]，而高分子量HA(Mr>1×106Da)由于其优异的保湿粘弹性及润滑作用，在医药器械及高端化妆品的应用越来越广泛[4-7]。
兽疫链球菌被广泛用于工业上透明质酸的生产，由于兽疫链球菌是一种对营养要求苛刻微生物，培养基中往往会使用动物来源的有机氮源，如胰蛋白胨、牛骨胨、脑心浸出物等[8]，这给透明质酸的市场应用带来一定的限制。随着市场对食品、医药、保健品产品的安全性和可追溯性要求越来越严，替代动物来源的有机氮源将成为一种趋势。本文主要研究了透明质酸生产培养基中，4种非动物源蛋白胨(酵母蛋白胨FP103，小麦蛋白胨FP450，大豆蛋白胨FP420，非动物源混合蛋白胨FP501)对动物源蛋白胨的替换，这为透明质酸无动物源培养基的优化提供了借鉴和指导意义。
蛋白胨，是高蛋白原料经过水解生产而成的，富含多肽、氨基酸、矿物质离子等营养，主要用作微生物发酵的氮源。根据蛋白质的来源不同，蛋白胨分为动物源、植物源和酵母源，目前透明质酸工业生产主要使用牛骨蛋白胨。
材料与方法
菌种：兽疫链球菌
培养基：
种子培养基：葡萄糖 5g/L，酵母浸粉FM408 5g/L，胰酪蛋白胨FP318 15g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，pH 7.0
发酵培养基：葡萄糖 70g/L，酵母浸粉FM408 6g/L，蛋白胨19.5g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，味精 4.5g/L，pH 7.0
实验方法
菌种在斜面培养基培养24h后，接种到液体摇瓶培养中，500ml摇瓶装液量200ml，摇床转速200rpm，37℃培养24h备用。5种蛋白胨的应用对比测试，使用3L发酵罐。发酵罐装液量1.8L，初始搅拌转速200rpm，发酵10h后，每隔1h提高转速50rpm至发酵结束。初始通气量为0.5L/min，发酵10h后调整通气量为1L/min，发酵14h后提高通气量为1.5L/min。整个发酵过程，通过流加NaOH维持pH为7.0。
检测方法
葡萄糖、乳酸检测方法：取发酵液稀释20倍，5000rpm离心5min，取上清液，使用深圳西尔曼M900生物传感器检测葡萄糖和乳酸含量。
OD值检测方法：取发酵液稀释至合适倍数，用紫外-可见光分光光度计在600nm处进行检测。
透明质酸检测方法：采用Bitter--Muir氏法[9]。
生产用骨胨，由透明质酸生产厂家惠赠;酵母蛋白胨FP103、牛骨蛋白胨FP326均由安琪酵母股份有限公司提供;大豆蛋白胨FP420、小麦蛋白胨FP450、混合蛋白胨FP501均由实验室制备。
生产用骨胨，(b) 牛骨胨FP326，(c) 酵母蛋白胨FP103，(d) 大豆蛋白胨FP420，(e) 小麦蛋白胨FP450，(f) 混合蛋白胨FP501
由图(a)和图(b)可知，不同厂家、不同工艺的牛骨胨，对透明质酸发酵的影响巨大。使用工业生产用牛骨胨，3h-6h为对数生长期，6h-14h生物量仍保持持续的提升，终OD值达到10.6;牛骨胨FP326的迟滞期较长，6h之后才进入对数生长期，12h进入稳定期，OD仅到9.0。表明生产用牛骨胨培养兽疫链球菌可促使其快速生长，且使菌体细胞活性保持更长的时间。同时，(a)组中葡萄糖在对数期迅速被消耗，转变为菌体的积累，6h后乳酸合成达到20g/L后便不再大量合成;而使用纯牛骨胨FP326，葡萄糖消耗速率慢，在整个发酵周期内乳酸不断积累，18h乳酸含量超过30g/L。更为重要的是，使用生产用骨胨培养，透明质酸在14h开始迅速合成，18h达到9.43g/L，而使用牛骨胨FP326组透明质酸产率仅4.6g/L。
图(c)、(d)、(e)、(f)显示的是不同的非动物源蛋白胨培养兽疫链球菌产透明质酸的发酵过程图，由图可知，酵母蛋白胨FP103对于菌体的生长有极明显的促进作用，14h的OD值达到12，高于其他组，透明质酸产率5.2g/L。大豆蛋白胨FP420培养组迟滞期较长，9h对葡萄糖基本不消耗，在生长后期菌体有衰亡，最终菌体量、透明质酸产率均较低。小麦蛋白胨FP450培养组OD不到10，乳酸和透明质酸产量均高于大豆蛋白胨和酵母蛋白胨，表明菌体活力高，最终葡萄糖消耗完全，大量转化为产物，但代谢途径更趋向产生乳酸。采用酵母、大豆和小麦源的混合非动物源蛋白胨FP501培养，透明质酸产率、发酵液OD、葡萄糖消耗情况均和生产用骨胨接近，透明质酸产率超过生产用骨胨，达到9.55g/L。推测可能是不同来源的蛋白胨分别在促进菌体量增长和产物积累上形成了优势互补。
非动物源混合蛋白胨FP501最终的OD值保持在11左右，主要副产物乳酸也被很好的控制，最终浓度为22.1g/L。发酵18h，透明质酸的产率达到9.55g/L，与生产用牛骨胨相比，提高1.27%。
三、讨论
透明质酸的主要生产菌种兽疫链球菌，是一种对营养要求苛刻的乳酸链球菌，其为某些氨基酸的营养缺陷型细菌，包括赖氨酸、谷氨酸、精氨酸、半胱氨酸等，另外对于自身代谢的一些基本营养物质，也不能充足供给[10-11]。因而透明质酸发酵第一个需要解决的问题是，发酵前期提供足够丰富的营养，特别是兽疫链球菌不能自己合成的，生产上具体表现是迟滞期相对短，生物量上升缓慢。保持发酵后期细胞的代谢活力，抑制透明质酸合成的竞争代谢流是保证透明质酸高效合成的另一个难点。而由于透明质酸的直接前体UDP-N-酰基氨基葡萄糖是细胞壁的重要成分，菌体量和单位细胞透明质酸合成之间需要有一个平衡点，特别是发酵后期。
通过筛选不同来源的蛋白胨进行对比实验，我们可以看到，不同的蛋白来源，不同工艺，对透明质酸发酵过程的生物量、糖耗速率、乳酸含量和透明质酸产率的影响是各不相同的。非动物源蛋白胨FP501在3L发酵体系中可以达到生产用骨胨的同等水平，具备较强的替代可行性，这对未来透明质酸的安全生产、产品认证和质量追溯上具有非常大的利好。但氮源调整后，对后续透明质酸的提取、分子量大小的影响等，需要进一步的研究和验证。——论文作者：郑重 12 李啸 12 丁永志 2 伍业旭 2 张小龙 1
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