基因修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗帕金森病的研究进展
发布时间：2020-04-27
摘要帕金森病进展缓慢，以神经退化为特征，主要病因是选择性中脑黑质多巴胺能神经元的丧失和纹状体多巴胺含量的显著减少。传统疗法有药物治疗和外科治疗，而近来较理想是基因治疗和干细胞移植治疗，包括胚胎干细胞、神经干细胞和间充质干细胞等。骨髓间充质干细胞作为体内一种多功能干细胞，具有成为基因治疗靶细胞的显著优势，并已被普遍用于人类疾病的研究。然而，对帕金森病进行基因治疗的目的基因选择具有多样性。因此，本文主要针对近十年基因治疗帕金森病的目的基因的选择相关研究进展作一综述。
关键词帕金森病，骨髓间充质干细胞，基因治疗
1.引言
帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)是一种中老年常见的进展缓慢的神经系统变性疾病，以选择性中脑黑质多巴胺(Dopamine,DA)能神经元丧失和纹状体多巴胺含量明显减少为主要特点。临床表现为：静止性震颤、行动迟缓、肌张力增高、平衡障碍等，该病严重影响着人们的生活质量。世界卫生组织(WorldHealthOrganization,WHO)和有关文件报导全球该病患者已超过400万[1]。骨髓间充质干细胞(BoneMesenchymalStemCells,BMSCs)是一种多功能干细胞，可多向分化，且拥有较强增值能力。近几十年来，大量的研究报道基因修饰的BMSCs在细胞和基因治疗帕金森疾病方面具有广阔的应用前景。然而，对帕金森病进行基因治疗的目的基因选择多种多样，因此，为寻找一种或一类更加高效、简便且稳定的基因治疗方法，还须要对目的基因的选择进行更加深入的总结与探索。
2.PD治疗方法概述
PD的治疗研究发展迅速，途径多种多样，传统的方法包括药物治疗和手术治疗，而近年研究较多的主要有基因治疗和干细胞移植治疗。
2.1.药物治疗
药物治疗常采用的是左旋多巴制剂，该药可通过血脑屏障，在脑内转变为多巴胺，以发挥替代治疗的作用[2]。然而，药物治疗大多是暂时缓解症状，不能进行根治，还会产生并发症和副作用。
2.2.手术治疗
目前有两种，其一是脑深部电刺激术(Deepbrainstimulation,DBS)，其二是神经核损毁术[3][4]，这两种方法对外科技术和医疗费用的要求很高，只能使患者的症状得到一定程度的改善，并且其具体的机制仍然不明确，手术创伤大，使用对象局限，远期效果不佳，也并非一种理想的治疗手段。
2.3.细胞移植治疗
多选择胚胎干细胞(Embryonicstemcells,ESCs)、神经干细胞(Neuralstemcells,NSCs)和骨髓间充质干细胞。其中以胚胎干细胞作为供体细胞或载体细胞的治疗效果最佳，但是因此而引起的胚胎来源相关伦理道德问题是不能忽视的。
2.4.基因治疗
基因治疗是将神经营养因子基因或一些其他的特定基因通过转染等介导方式导入适当的靶细胞中，使靶细胞能够稳定表达相应的基因产物，然后将其移植到受损侧纹状体，使之在体内表达携带的基因并发挥作用。也可使用质粒或者病毒载体直接把目的基因转染到大脑病变部位[5]。基因治疗不但可以纠正脑内DA含量的缺陷，还能保护残存的DA能神经元，是当前PD治疗的研究热点，并已进入临床试验阶段。
3.骨髓间充质干细胞是理想的基因修饰靶细胞
基因治疗理想的靶细胞应具有来源容易，长期的自我更新能力，较小的免疫排斥反应，易被操控和基因修饰等优势。骨髓间充质干细胞是骨髓细胞中除造血干细胞之外的另外一种多功能干细胞，来源于中胚层，具有来源丰富，取材简便，体外易培养和扩增以及自我更新和多向分化能力强等优点，其中来源于外胚层的神经组织，在特定的诱导条件下，可分化为多巴胺能神经元，并且不涉及伦理道德问题，使得BMSCs成为理想的基因治疗的靶细胞。然而，BMSCs仅占骨髓细胞的0.01%，因此，必须对其进行体外的分离、纯化和扩增，再经表型鉴定之后才能用于其他研究及临床试验。
BMSCs的纯化培养方法目前主要有三种：全骨髓贴壁培养法、密度梯度离心法以及流式细胞仪分选法。根据BMSCs具有贴壁生长的特性，我们采用全骨髓贴壁培养法进行分离;由于骨髓中各类细胞的密度不同，我们可选用密度梯度离心法，采用Percoll或Ficoll与骨髓悬液混合然后离心获取得单个核细胞，这个方法的分选纯度很高;而流式细胞仪分选法则是基于BMSCs体积小、相对缺少颗粒、具有相对稳定的细胞表面标志等来进行的分离。以上方法各有优缺点，但从简便、高效、经济方面综合考虑，现在多采用贴壁法进行分离BMSCs[6]。
4.PD基因治疗的目的基因选择
用于PD基因治疗的目的基因主要有：促进DA合成的酶类，多种神经营养因子基因、信号分子及抗凋亡基因等。本文重点阐述国内外近十年关于目的基因选择的研究现况。
4.1.神经营养因子
神经营养因子(Neurotrophicfactors,NTF)，根据其结构和功能，我们将它们分为三类：①神经生长因子家族，如神经生长因子(Nervegrowthfactor,NGF)、脑源性神经营养因子(Brainderivedneurotrophicfactor,BDNF)和神经营养因子3(Neurotrophin3,NT3)、神经营养因子4/5(Neurotrophin4/5,NT4/5)等;②胶质细胞源性神经营养因子家族，如胶质细胞源性神经营养因子(Glialcellline-derivedneurotrophicfactor,GDNF)、神经秩蛋白(Neurturin，NRTN或NTN)、Rrtemin(ARTN)、Persephin(PSPN);③保守性多巴胺神经营养因子家族，如中脑胶质细胞源性神经营养因子(Mesencephalicastrocyte-derivedneurotrophicfactor,MANF)和保守性多巴胺神经营养因子(Conserveddopamineneurotrophicfactor,CDNF)等[7]。
4.1.1.GDNF
体内外的众多实验研究均证明GDNF能够促进中脑黑质多巴胺能神经元、背根神经节和交感神经元等多种神经元的存活[8]。此外，GDNF被认为是当前能保护多巴胺能神经元的最有效的神经营养因子。GDNF恒久作用下可显著增多纹状体中多巴胺能神经元的数目，从而有效改善其由神经缺失所导致的临床症状。
2004年，孙兵等[9]初次选取GDNF作为目的基因，他们首先从新生大鼠胎脑组织中成功克隆GDNF的全长cDNA，然后利用阳离子脂质体法转染至P3或P4的BMSCs。结果发现转染后并未显明改变BMSCs的多向分化潜能，诱导后仍可分化为神经样细胞。将转染成功的BMSCs移植入PD模型大鼠患侧的纹状体，GDNF能在脑内较长时间表达，并有效地改善了PD大鼠的行为学症状，长期作用下还可增加DA细胞的数量。
2006年，苏雅茹等[10]构建了GDNF的慢病毒表达质粒，使之在BMSCs内过表达，发现其能减轻Lactacystin(乳胞素，蛋白酶抑制剂)引发的PC12细胞损伤。将GDNF-BMSCs移植入lactacystin所致的PD大鼠模型损毁侧纹状体内，结果显示GDNF-BMSCs治疗组明显优于LacZ-BMSCs(半乳糖苷酶基因)组。
2011年，Shi[11]等选用慢病毒载体将酪氨酸羟化酶(Tyrosinehydroxylase,TH)和GDNF基因分别转入BMSCs，并移植纹状体内用于PD大鼠的治疗，最后发现相比于其他治疗组，将表达TH和GDNF基因的BMSCs共同移植治疗效果更佳。
近几年已有人将hGDNF重组入hBMSCs用于PD的治疗研究，发现其培养液对于体外培养的腹侧中脑组织多巴胺神经元的存活也有提升作用，从而更有力的说明了BMSCs作为神经营养因子载体用于PD治疗的广阔前景[12]-[14]。
4.1.2.NGF
在神经损伤过程中，NGF特异性地表达上调，从而发挥其内源性的神经保护和修复功能。此外，NGF通过增强谷胱甘肽过氧化物酶等多种酶的作用以减轻自由基的损伤，它还可以结合并磷酸化Bcl家族中促凋亡的Bad蛋白，使抗凋亡的Bcl-2和Bcl-XL表达量增加，从而发挥其抑制细胞凋亡的能力。所以我们推测，NGF基因修饰的BMSCs之所以能有效治疗PD大鼠，可能与NGF的神经保护功能有关[15]。
2010年朱晓东等[16]分别用转染GFP-NGF(神经生长因子)、GFP-Noggin(一种具有神经调控作用的蛋白)的BMSCs单独和联合治疗6-羟基多巴(6-hydroxydopamine,6-OHDA)诱导的帕金森大鼠模型，结果证实NGF和Noggin共同存在促进了BMSCs向神经元样细胞的分化，模型大鼠纹状体内神经递质的含量显著增加，对神经功能的修复作用增强。
2014年，毕勇等[17]将人β-神经生长因子(β-NGF)修饰的BMSCs移植入PD模型大鼠脑内，并探讨其对模型大鼠行为学的影响。结果发现人β-NGF基因修饰的BMSCs脑内移植能明显改善PD模型大鼠行为学症状，具有潜在的临床应用价值。
4.1.3.NTN
NTN(Neurturin)在结构和功能上与GDNF类似，两者同属TGF-β超家族的亚家族，于DA能神经元具有特异性的营养、支持、保护和损伤修复作用。黄月等[18]人构建了TH和NTN的双基因表达载体，并转染至BMSCs，获得了能稳定表达TH和NTN蛋白的BMSCs，再将之移植入PD大鼠纹状体中，发现TH和NTN联合治疗，既增加了脑内DA的合成，同时又保护了DA能神经元，加上BMSCs自身的损伤修复能力，取得了很好的效果。
4.1.4.BDNF
BDNF(脑源性神经营养因子)作为一种神经生长因子，最重要的生理学作用是维持神经元的存活和功能。有研究证实，BDNF对DA能神经元具有特异性、选择性的保护作用。经侧脑室移植BDNF修饰的BMSCs能显著改善PD大鼠的行为能力，提高中脑黑质BDNF和TH蛋白的含量[19]。
4.1.5.Neurturin
2012年huang[20]将共转染TH和neurturin基因的BMSCs移植入帕金森模型大鼠的纹状体内。几周后，除了运动机能有改善外，受损脑内TH及neurturin表达上调，此外，多巴胺及其代谢产物3，4二羟基苯乙酸水平显著上升，结果提示转染TH和neurturin基因的BMSCs可提高PD大鼠脑内多巴胺含量，改善其旋转行为。
4.1.6.CDNF
最新研究表明，CDNF能有效的保护及修复DA能神经元，在PD大鼠模型中，长期低剂量注射CDNF能改善其帕金森症状。CDNF作为一种分泌性蛋白，被大量分泌到细胞外，因此，细胞培养基中含有大量CDNF蛋白。韩暄等[21]通过转染将CDNF基因导入大鼠BMSCs，显著上调了CDNF蛋白的表达。再将成功转染CDNF基因的BMSCs的细胞培养液加入6-OHDA诱导的PD细胞模型中，P12细胞的凋亡率明显下降，进一步证明了CDNF对帕金森病的保护作用。
4.1.7.PSPN
PSPN是隶属于GDNF家族的一类神经营养因子，有研究发现其对特定的神经元具有营养支持作用。Yin等[22]用BMSCs和经PSPN修饰的BMSCs分别移植治疗PD模型大鼠，发现经PSPN修饰后的BMSCs在脑内的存活率高于未被修饰的，并且纹状体中的DA含量以及大鼠的行为学症状均有显著的改善。
4.2.NuclearrelatedFactor1
Nurr1(nuclearrelatedfactor1)是甾族-甲状腺激素孤儿核受体超家族的成员之一，是一种转录因子。近年来的研究发现，Nurr1基因的表达对于中脑腹侧多巴胺能神经元分化、成熟及存活均起重要作用。6-OHDA引起的中脑DA能神经元变性可导致Nurr1mRNA表达相应降低，表明Nurr1与帕金森病可能存在一定的联系[23]。
徐浩文等[24]发现过表达Nuur1基因的BMSCs可一定程度上治疗PD，且其能在大鼠纹状体内存活8周以上并有效表达一段时间，Nuur1之所以发挥治疗作用，是因为Nuur1的过表达可促进BMSCs的多巴胺转运蛋白(Dopaminetransporters,DAT)的生成，同时提高脑内DA的量，从而显著改善PD模型大鼠的旋转症状，此实验还提示该方法能在一段时期内维持纹状体内相对较高的多巴胺、二羟苯乙酸和高香草酸水平。
4.3.促进DA合成酶
促进DA合成的酶主要有：酪氨酸羟化酶、芳香族氨基酸脱酸酶和三磷酸鸟苷酸环化水解酶-I。中脑合成的DA是由酪氨酸先通过TH转化生成左旋多巴(L-dopa)，再经芳香族氨基酸脱羧酶(AromaticL-aminoaciddecarboxylase,AADC)的作用，L-dopa脱羧生成DA。TH在整个过程中充当限速酶，四氢喋呤(Tetrahydrobiopterin,BH4)是第一步酶促反应的辅酶。BH4由GTP生成，GTP环化水解酶I(GTPcyclohydrolaseI,GCH-I)又是BH4的第一步酶促反应的限速酶[25]。
Lu等[26]构建携带TH的腺病毒载体，并成功转染至BMSCs中，将可表达TH的BMSCs移植入PD大鼠的纹状体内，6周后免疫组织化学法检测TH表达情况，高效液相色谱-电化学法(HPLC-ECD)测定多巴胺的水平，结果显示移植点周围有TH的表达，TH基因表达效率达到75%，移植后大鼠的不对称旋转行为也得到明显改善，并且与LacZ-BMSCs移植组比较，TH-BMSCs移植组损毁的侧纹状体内多巴胺含量明显较高，以上的数据均提示基因修饰的BMSCs可用于基因治疗。
若将DA合成的3个关键酶TH、AADC和GCH-I都转染入BMSCs细胞，并用以治疗PD模型大鼠。移植后4周、8周、12周大鼠的行为学症状得到明显改善，并于移植12周后HPLC-ECD测定损毁侧纹状体和黑质内DA及其代谢产物3，4-二羟苯丙酸(DOPAC)的含量，结果提示三重基因联合脑内治疗可能是比双重基因移植治疗更佳的帕金森病治疗方法[27]。
刘晓艳等[28]后来发现Nurr1能显著增强TH修饰的BMSCs中THmRNA的表达和TH阳性细胞数，之后他们又将TH和Nurr1双基因修饰的BMSCs移植入PD大鼠，其基因治疗效果更显著，为下一步移植治疗帕金森病奠定了基础。
基因修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗帕金森病的研究进展相关期刊推荐：《解剖学报》创刊于1953年，是由中国解剖学会主办，代表我国解剖学科发展水平的高级综合性学术期刊。主要刊载细胞学、分子细胞生物学、组织胚胎学、干细胞和组织工程学、神经生物学、大体解剖学和比较解剖学、人类学诸学科中创建性、前沿性的科研论著。
