乳酸菌和米根霉混合固态发酵对黑青稞生化成分的动态变化

发布时间：2020-04-25

　　摘要:本研究以黑青稞为原料，探究2株乳酸菌(R1、R5)、1株米根霉单独及混合发酵黑青稞过程中生化成分的动态变化。结果表明，3株菌株单独发酵过程中，R5发酵的黑青稞其pH明显下降，最低达到4.32±0.01，且总酸含量显著高于其余两株菌，最终达到2.52%±0.12%;而米根霉发酵的黑青稞其还原糖含量及乙醇含量明显高于R1、R5，最高分别达到(6.94±0.22)、(9.19±0.49)mg/g;R1、R5发酵得到的氨基酸态氮含量较为接近且高于米根霉，最终分别达到(0.10±0.01)、(0.11±0.01)mg/g。混合发酵结果表明，混菌发酵能显著提高黑青稞发酵制品的营养品质、改善其风味，其中R5+米根霉混合发酵的黑青稞制品在发酵过程中pH下降较快，且产酸较多，pH由降低5.65±0.08至4.16±0.08，总酸含量由0.48%±0.03%增加至7.16%±0.03%，乙醇含量较低，最终仅为(8.25±0.35)mg/g，氨基酸态氮含量较高，最终达到(0.11±0.01)mg/g，同时感官品质优于其他发酵组合，48h评分最高，达到(86±0.89)分，适宜发酵制备低酒精、高营养型黑青稞制品。而R1+米根霉混合发酵的黑青稞制品产酸较少，但其乙醇含量最高，最终达到(9.80±0.60)mg/g，适宜发酵低酸、高酒精黑青稞发酵制品。综合考虑，最终确定混合固态发酵48h时其黑青稞制品营养品质及感官特性最佳。根据发酵黑青稞产品的品质及风味要求，可选择适宜的混合发酵菌株。该研究可为开发黑青稞产品工业化生产奠定基础。

　　关键词:黑青稞，乳酸菌，米根霉，混菌固态发酵，生化成分，营养品质，动态变化

　　青稞又称裸大麦，是青藏高原地区的独有物种资源，也是藏区人民的主要口粮[1]。黑青稞是一类极其珍贵的青稞种质资源[2-4]，具有多种益于人体健康的矿质元素[5]，如锌、铜、铁等，同时黑青稞具有高蛋白质、高膳食纤维、高维生素、高β-葡聚糖[6]等特点，富含独特的花青素类物质[7-10]，具有较强的消除体内自由基和抗氧化作用[11-13]，能够延缓衰老、预防癌症[14]。当前，青稞的加工方式主要以粮油制品、发酵青稞酒为研究重点，同时针对β-葡聚糖[15-16]、青稞多肽等功能成分也有大量研究，但针对混菌型青稞发酵技术的研究则非常少。而目前对于黒青稞的研究也主要集中在农艺性状[17]、营养成分测定[18]、功能成分分离提取[19]等方面，其加工综合利用研究相对较少，大多集中在黑青稞酒、黑青稞醋、黑青稞米、黑青稞片等产品，对于以固态黑青稞为研究对象对其发酵过程中生化成分变化的研究更是几乎空白，亟需加强黑青稞发酵产品的研究及开发，提高我国黑青稞资源的利用率。而固态发酵是一种成本较低、利用率较高、污染较少的生产方式，不仅能够实现黑青稞资源的广泛利用，还能提高原料的营养及功能性价值，具有广阔的应用前景。

　　当前，乳酸菌是公认的、安全的益生菌，其发酵制品深受大众喜爱，且乳酸菌具有改善肠道微生态环境，增强免疫力和消除机体炎症等多种生理活性。但由于其自身淀粉酶和蛋白酶相对不发达，难以直接有效利用基质中的营养成分，单独发酵黑青稞成品品质低、风味差。前期试验发现，乳酸菌R1和乳酸菌R5发酵性能均较高，且发酵产物品质均较好，但两株菌区别在于混合发酵后黑青稞制品品质不同，R1混合发酵后制品乙醇含量高，R5混合后制品含酸高、乙醇低，对于不同类型的黑青稞发酵制品，可以选择不同的菌株进行混合，为黑青稞制品类型的选择提供依据。因此，本研究选择固态发酵的传统菌种—米根霉和乳酸菌混合发酵，探究黑青稞在混菌固态发酵过程中生化成分的变化规律，以达到乳酸菌固态发酵黑青稞的目的。以期为科学判断黑青稞发酵产品终点和控制发酵过程提供了技术参数，也为进一步开发黑青稞功能性产品提供新的思路和研究方向。

　　1材料与方法

　　1.1材料与仪器

　　乳酸菌R1、R5由青海省青藏高原农产品加工重点实验室分离西藏灵菇乳得到，经鉴定均为假肠膜明串珠菌;黑青稞(昆仑17号)青海省农林科学院作物育种栽培研究所提供;米根霉发酵剂安琪酵母股份有限公司;葡萄糖标准品(纯度≥95.0%)合肥博美生物科技有限责任公司;其他试剂均为分析纯。

　　pHS-3C型精密酸度计上海仪电科学仪器股份有限公司;LDZX-75KB型立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂;SW-CJ-2型双人净化工作台苏州净化设备有限公司;AL204型分析天平梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;N4S紫外可见分光光度计上海仪电分析仪器有限公司;LRH-150型生化培养箱上海齐欣科学仪器有限公司;THZ-300C型恒温振荡器上海一恒科学仪器有限公司;BCD-649WE型冰箱青岛海尔股份有限公司;DL-5M型高速台式冷冻离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司。

　　1.2实验方法

　　1.2.1培养基的配制MRS培养基:蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母提取物5g、K2HPO42g、柠檬酸二铵2g、乙酸钠5g、葡萄糖20g、吐温801mL、MgSO4·7H2O0.58g、MnSO4·4H2O0.25g、琼脂15g、蒸馏水1L，调节pH到6.2～6.4，121℃下灭菌30min。

　　1.2.2菌种的活化参照杨希娟等[20]的方法，用接种环挑取斜面菌种两环，接种于装有100mLMRS液体培养基的250mL三角瓶中，37℃培养24h进行活化。

　　1.2.3黑青稞发酵工艺流程黑青稞挑选、去杂→清洗→浸泡→沥干→蒸煮→冷却→接菌→发酵→成品

　　挑选、清洗:选用黑青稞饱满、去除泥土、沙尘，清洗后用纱布沥干;浸泡:室温下浸泡24h;蒸煮:常压下蒸煮20min。

　　1.2.4固体发酵

　　1.2.4.1乳酸菌单独发酵称取一定量的黑青稞于500mL烧杯中，向其中加入体积比为1∶2的蒸馏水，并在室温下浸泡24h。用纱布沥干水分后，置于蒸锅中常压下蒸煮20min，并分装于250mL三角瓶中，冷却后按5%(v/w)接种量分别接入乳酸菌R1和R5，置于30℃下培养箱中发酵，每隔12h取样。

　　1.2.4.2米根霉单独发酵称取一定量的黑青稞于500mL烧杯中，向其中加入体积比为1∶2的蒸馏水，并在室温下浸泡24h。用纱布沥干水分后，置于蒸锅中常压下蒸煮20min，冷却后按0.5%(w/w)的接种量接入米根霉，置于30℃下培养箱中发酵，每隔12h取样。

　　1.2.4.3乳酸菌与米根霉混合发酵称取黑青稞于500mL烧杯中，加入体积比为1∶2的蒸馏水，在室温下浸泡24h。用纱布沥干水分后，置于蒸锅中常压下蒸煮20min，冷却后接入0.5%(w/w)的米根霉，并分别接入5%(v/w)的乳酸菌R1和R5，置于30℃下培养箱中发酵，每隔12h取样。

　　1.2.5生化成分的测定发酵取样后，分别测定黑青稞在发酵过程中pH、总酸含量、乙醇含量、还原糖含量、氨基酸态氮含量等成分，明确单独发酵、混合发酵的变化规律。

　　1.2.5.1pH测定取10g发酵样品，将其捣碎并加入100mL无CO2的蒸馏水，边浸泡边摇动15min，将其过滤，取滤液采用pHS-3C型精密酸度计直接测定[21]。

　　1.3数据处理

　　所有实验均重复3次。数据用Design-Expert8.06进行分析。

　　2结果与分析

　　2.1黑青稞发酵过程中pH的变化

　　黑青稞发酵过程中的pH与发酵菌株生长繁殖和代谢产物的积累密切相关。由图1可知，当两株乳酸菌R1、R5单独发酵黑青稞时，0～12h黑青稞pH迅速下降，R1、R5发酵黑青稞的pH分别降低至(4.70±0.01)、(4.37±0.22)，之后随着发酵时间的延长其pH变化趋于稳定;而米根霉单独发酵黑青稞时，在0～24h，其pH下降迅速，其后pH稳定在4.41～4.64范围内。但从图1可知在整个发酵过程中R5单独发酵的黑青稞其pH始终低于R1、米根霉单独发酵的结果，说明R5产酸能力与R1、米根霉相比较强。

　　将两株乳酸菌R1、R5分别与米根霉进行混合发酵黑青稞，由图1可知，随着发酵时间的延长其pH均呈现下降趋势。0～12h时R1+米根霉混合发酵黑青稞其pH迅速下降，之后趋于稳定;而在0～48h时R5+米根霉混合发酵黑青稞其pH下降迅速，48h其pH为(4.17±0.06)，其后趋于稳定，且在整个发酵过程中，R5+米根霉发酵的黑青稞与菌株单独发酵及R1+米根霉混合发酵相比，其pH最低，说明R5+米根霉混合发酵产酸能力最强，这可能是由于R5本身产酸能力较高，在混合发酵中其产酸能力占优势，同时米根霉酶解产生的物质能够促进R5发酵产酸，使整个发酵更完全。

　　2.2黑青稞发酵过程中总酸含量的变化

　　黑青稞发酵过程中总酸含量的变化如图2所示。由图2可知，随着发酵时间的延长，黑青稞的总酸含量均呈现逐渐增加趋势。0～12h，两株乳酸菌R1、R5及米根霉单独发酵黑青稞其总酸含量增加迅速，24h时总酸含量已达到1.49%±0.13%(R1)、1.98%±0.04%(R5)、1.94%±0.05%(米根霉)，其后随着发酵时间的延长其总酸含量趋于稳定，总酸含量变化规律与pH变化正好相反，同时R5总酸含量高于R1、米根霉，符合上述三株菌pH变化趋势，R5产酸能力与R1、米根霉相比较强。

　　由图2可知，混合发酵黑青稞过程中其总酸含量也均呈现上升趋势，0～48h时，R1+米根霉、R5+米根霉混合发酵的黑青稞其总酸含量增加缓慢，48h后随着发酵时间的延长其总酸含量迅速升高，两组混合发酵菌株发酵黑青稞其总酸含量明显高于三株单独发酵菌株。另外，R5+米根霉混菌发酵得到的总酸含量最高，60h时其总酸含量就已达到5.08%±0.04%，这可能是由于米根霉本身具有较高的酶系，能够将黑青稞的淀粉分解为小分子碳源物质，同时乳酸菌R5本身具有较强的产酸能力，能够直接利用这些物质，使得整个发酵更为充分，产酸较多。此结果说明添加乳酸菌R5能够显著增强其黑青稞发酵过程中总酸含量，能够改善黑青稞发酵制品风味。

　　2.3黑青稞发酵过程中乙醇含量的变化

　　黑青稞发酵过程中乙醇含量的变化如图3所示。由图3可知，随着发酵时间的延长，黑青稞发酵过程中乙醇含量均先上升后趋于稳定。菌株单独发酵时，在0～36h，R1发酵黑青稞其乙醇含量增加，其后随着发酵时间的延长其乙醇含量趋于稳定，36～72h乙醇含量在0.45～0.53mg/g之间;而R5在0～48h随着发酵时间的增加乙醇含量增加，48h时乙醇含量已达到(2.53±0.22)mg/g，其后乙醇含量趋于稳定;米根霉在0～24h大量产生乙醇，24h时已达到(7.85±0.02)mg/g，其后乙醇含量基本达到稳定，其产乙醇含量明显高于两株乳酸菌。在菌株单独发酵黑青稞过程中，米根霉代谢产乙醇含量最高，这可能与米根霉自身的糖化酶有关，能够高效利用黑青稞中的淀粉，达到高效乙醇发酵。

　　混合发酵时，在0～24h，两组混合发酵得到的黑青稞其乙醇含量增加迅速，其后随着发酵时间的延长其乙醇含量仍处于上升趋势，但较为缓慢。48h时，R1+米根霉、R5+米根霉发酵得到的黑青稞制品其乙醇含量分别为(9.23±0.33)、(8.47±0.39)mg/g;60h后R1+米根霉混合发酵的黑青稞产乙醇含量相较于菌株单独发酵及R5+米根霉混合发酵最高，达到(9.40±0.41)mg/g;而R5+米根霉混菌发酵的黑青稞其乙醇含量在整个发酵过程中均低于米根霉单独发酵及R1+米根霉混合发酵。从以上结果可知，米根霉与黑青稞发酵产乙醇密切相关，在米根霉单独发酵时，其乙醇含量就已达到较高水平，而添加R1进行混合发酵更能促进发酵产乙醇，使黑青稞发酵制品更具风味。但在R5+米根霉混合发酵时，其乙醇含量较低，这可能是由于R5本身具有较高的产酸能力，而产乙醇能力相对较弱，在与米根霉混合发酵时，能够高效利用小分子碳源物质产生更多的酸，致使乙醇含量相对较低，这对于研制低酒精黑青稞发酵制品更为有利。

　　2.4黑青稞发酵过程中还原糖含量的变化

　　黑青稞发酵过程中还原糖含量的变化如图4所示。由图4可以看出，三株菌株单独发酵时，随着发酵时间的增加，两株乳酸菌单独发酵黑青稞的还原糖含量呈现逐渐降低趋势，且在0～48h乳酸菌R5发酵黑青稞的还原糖含量明显低于R1，但48h后，两株菌发酵黑青稞的还原糖含量均趋于稳定，且还原糖含量较为接近，48h时分别为(0.22±0.01)(R1)、(0.20±0.01)mg/g(R5)。而米根霉单独发酵黑青稞时，其还原糖含量随着发酵时间的增加呈现出先增加后略下降趋势，在48h达到最大，为(6.94±0.22)mg/g。两株乳酸菌发酵黑青稞其还原糖含量均下降，可能是由于菌株利用黑青稞中的碳源物质进行增菌和代谢产生乙醇及其他代谢产物，当发酵时间达48h，其后菌株发酵能力受发酵产物及环境的影响，其还原糖含量趋于稳定。而米根霉发酵黑青稞其还原糖含量先增加后略下降，可能是由于米根霉具有较为发达的酶系，在发酵过程中能够有效利用黑青稞中的淀粉成分并代谢产生还原糖，但当发酵时间过长，其整个发酵体系不利于米根霉的生长及发酵，还原糖含量略有下降。

　　乳酸菌和米根霉混合固态发酵对黑青稞生化成分的动态变化相关期刊推荐：《食品工业科技》是国家轻工业联合会(原国家轻工业部)主管，北京市食品工业研究所主办。综合性科技期刊。内容：集市场分析，技术探讨于一身，市场分析包括：权威导航，行业观潮，法规前沿，安全视角，互动平台，展会风景线，企业先锋，资讯纵横等，文章以宏观分析为主，旨在为企业决策者了解市场，拓展思路提供帮助。