水环境中三氯生残留对轮叶黑藻的生态毒性效应

发布时间：2020-04-18

　　摘要随着三氯生(TCS)在水体环境样品中不断被检出，其对水生生态系统的毒害效应引起了日益广泛关注。采用毒理学实验方法，研究了TCS低浓度长期暴露对轮叶黑藻的生态毒性效应。结果表明，0.05～0.5mg·L-1TCS暴露下，轮叶黑藻体内均有不同程度的TCS残留，其中0.1mg·L-1TCS处理组中植株体内TCS含量最大。与对照相比，轮叶黑藻叶片中叶绿素含量在整个暴露周期内呈现出抑制-促进-抑制的变化趋势，茎部叶绿素含量在暴露初期被显著抑制随后逐渐回升。植株叶片内可溶性蛋白含量呈现促进-抑制-促进的趋势，而茎部可溶性蛋白含量的影响则呈现出先促进后抑制的趋势。此外，TCS暴露对植株体内抗氧化防御系统具有破坏作用，且TCS对植株叶片和茎部抗氧化酶活性的影响具有差异性。上述结果为有效评估水体环境中TCS的生态风险提供了毒理学数据和理论依据。

　　关键词三氯生;轮叶黑藻;水环境;生态毒性效应

　　三氯生(TCS)是目前最为流行的一种广谱抗菌剂，其对病原性革兰氏阳性菌、真菌、酵母以及病毒等都具有广泛的杀灭和抑制作用，因而被广泛应用于肥皂、牙膏等日化用品中。我国由于人口众多，经济发展迅速，TCS消耗量非常显著，这些TCS会随着人类活动如洗漱、淋浴、卫生消毒等进入固废或水体中。Zhang等(2015)研究发现，2014年我国TCS使用量达100t·a-1排放到环境中的TCS约为66.1t·a-1。随着TCS的使用量日渐增加和化学分析检测技术的日益进步，近年来TCS相继在我国多地的水体样品中被检出，且检出率和检出浓度也越来越高。Chen等(2014)在中国东江流域和支流的多个断面进行TCS采样，检出率达到100%，最大浓度可以达到(141±12.6)ng·L-1。此外，TCS具有较强的亲脂性，其在水生生物中富集因子也较为显著。Ruszkiewicz等(2017)发现，孔雀鱼(Poeciliareticulata)在0.16mg·L-1的TCS浓度下暴露30d，在孔雀鱼脑、肌肉、肝中浓度分别为17.51、1.24、124.37ng·g-1(湿质量)。由于TCS具有类持久性、生物富集性、热稳定和难挥发性等特点，导致其可以在水体持久存在。

　　TCS在水体环境中长期残留以及在生物体内的富集，势必会对水生动植物造成不良的生态效应。Huang等(2016)和Orvos等(2002)研究表明，TCS对大型蚤(Daphniamagna)的半数效应浓度(48hEC50)为390μg·L-1，并且影响大型蚤的生存和繁殖。Capkin等(2017)发现，TCS对鲑鳟鱼的毒性影响表现为(96h-LC50)为0.05mg·L-1，并且对鱼的红细胞能造成明显DNA损伤，TCS与其他物质作用也会干扰荷尔蒙周期，产生肌肉松弛现象，对肾、肝、脾和腮有病理学影响，对基因表达的影响也很显著。水生植物的研究主要集中在TCS对微藻类的急性毒性效应。例如，陈东等(2018)研究发现，0.5～16mg·L-1TCS对蛋白小球藻(Chlorella)的增殖有抑制效应，半数效应浓度(96h-EC50)值为7.76mg·L-1;Huang等(2016)在铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)96h毒性试验中，通过透射电镜观察到TCS暴露过程中铜绿假单胞菌的细胞超微结构遭到破坏。然而，目前对于水体环境中TCS对大型藻类的毒性效应，尤其是TCS低浓度长期暴露的毒性效应研究相对匮乏。

　　轮叶黑藻(Hydrillaverticillata)作为典型的沉水植物，在我国水体环境中广泛分布。由于其整株浸于水中，且植株体表具有较好的吸附性能，因而对水体污染物胁迫的响应较为敏感。李国新等(2011)研究发现，轮叶黑藻对Pb有较快的吸附能力，10min后Pb的去除率达到74.54%。高艳(2017)研究发现，轮叶黑藻对Pb有很强的富集能力，同时Pb可减弱其抗氧化胁迫能力，导致叶绿体膜脂质发生过氧化损伤。目前关于水环境中TCS残留对轮叶黑藻毒性效应的研究很少。基于此，本实验以轮叶黑藻作为受试植物，研究了水环境中TCS低浓度长期暴露下，轮叶黑藻对TCS的吸收以及其体内叶绿素、可溶性蛋白、抗氧化酶活性等指标的变化情况，以期为TCS等新型污染物的生态风险评估提供毒理学基础数据和理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1实验仪器和供试材料

　　仪器:冷冻高速离心机(Centrifuge5804R，德国)，纯水仪(DW100，上海);超声波清洗器(KQ-500DE，上海)，氮吹仪(DCY-24Y，沈阳)，固相萃取装置(SPE-12A，北京)，烘箱(101-2ABS，上海)，分析天平(JA2003，上海)，紫外可见分光光度计(VARIANCary50，美国)，液相色谱-质谱联用仪(Maters2695-ZQ4000，美国)。

　　供试材料:供试植物-轮叶黑藻，属水鳖科，单子叶多年生沉水植物。轮叶黑藻芽孢购自辽宁省安新县冀中水生植物种植公司，于实验室培养2周，选取10cm左右长度的轮叶黑藻进行实验。实验用水为去离子水。营养液配置按照Hoagland培养液，轮叶黑藻采用10%Hoagland培养液。TCS购自阿拉丁生化科技股份有限公司(上海)，纯度≥96%，乙醇、乙腈、考马斯亮蓝、甲醇、乙酸乙酯、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、甲硫氨酸、氮蓝四唑、核黄素、愈创木酚(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。将TCS溶于二甲基亚砜(DMSO)，配制母液(5g·L-1)。

　　1.2实验设计

　　采用水培实验，模拟河流环境，在无色玻璃水缸(长35×宽20×高25cm)底部铺设一层4cm厚的底泥，每缸中放8L用去离子水配置的10%Hoagland培养液。水缸上面放置常规架灯提供光照，同时进行曝氧，实验装置如图1所示。选用株高10cm左右，鲜重约0.8g的轮叶黑藻进行实验。每个缸中定植20株，平均栽植在底层底泥上。

　　根据预实验结果，将TCS母液(5g·L-1)用去离子水逐级稀释后添加到培养实验水缸中，使培养液中的TCS浓度分别为0.05、0.1和0.5mg·L-1。对照组中无TCS添加，仅加入1mL的DMSO，水缸中DMSO浓度小于0.005‰，影响忽略不计。实验设置3个平行。

　　将各实验组放置于25℃恒温植物培养室中，光暗时间比为12h∶12h，实验进行28d。分别在培养的第7、14、21和28d采集植物样品按照相关分析测试方法进行前处理后保存待测。

　　1.3分析方法

　　1.3.1TCS在叶片中的残留将采集的植物叶片样品冷冻干燥24h，称取0.5g，剪碎研磨，用10mL乙腈提取，超声30min，在5000r·min-1下离心10min，取上清液转移到40mL棕色玻璃瓶中，重复以上步骤两次。用10%H2SO4调节pH至2～3后，利用固相萃取法进行浓缩富集。最后用氮吹仪将浓缩液吹干，用1mL乙腈定容并过0.45μm滤膜后，置于棕色小玻璃瓶中，保存在-20℃冰箱中待测。用液相色谱-质谱联用仪测定样品中TCS含量(Huaetal.，2005;曹光群等，2008;周世兵等，2008;周雪飞等，2010)，测试条件为:流动相为乙腈和水，采用梯度洗脱方式:0～8min，乙腈由20%匀速增加到85%;保持1min;9～10min乙腈由85%降回到20%。流速为1.0mL·min-1;进样体积为20μL;柱温为30℃;在负离子模式下进行扫描;紫外检测波长为282nm。本实验方法的回收率在75%～85%。

　　1.3.2生理生化指标的测定叶绿素采用分光光度法(李合生，1999)，新鲜样品取0.2g，加入少量石英砂和碳酸钙粉及2～3mL提取剂95%乙醇并剪碎研磨至匀浆，过滤定容。以665、649nm下的吸光值计算叶绿素含量，单位为mg·g-1。可溶性蛋白质量分数采用考马斯亮蓝G-250染色法(赵英永，2006)，配制蛋白质标准溶液和考马斯亮蓝G-250溶液，称取0.2g新鲜样品研磨匀浆，蒸馏水定容至10mL，离心上机。以540nm下的吸光值计算可溶性蛋白含量，以鲜重计，单位为mg·g-1。测定抗氧化酶之前处理样品，称取0.5g样品，蒸馏水研磨至匀浆，转入15mL离心管，蒸馏水反复冲洗研钵，合并清洗液并定容，于4℃下12000r·min-1离心10min。过氧化物酶(POD)采用愈创木酚法(李合生，1999;高俊凤，2006)，以470nm下的吸光值计算酶活性，以鲜重计，单位为U·g-1·min-1;过氧化氢酶(CAT)采用紫外吸收法，以240nm下的吸光值计算酶活性(李合生，1999;高俊凤，2006)，以鲜重计，单位为U·g-1·min-1;超氧化物歧化酶(SOD)采用氮蓝四唑法，以560nm下的吸光值计算酶活性(李合生，1999;高俊凤，2006)，以鲜重计，单位为U·g-1。

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　　1.4数据分析

　　采用MicrosoftExcel2013软件对数据进行处理，SPSS17.0统计分析软件对数据进行差异显著性检验(LSD法)，用英文小写字母表示各处理组间的差异显著性(P<0.05)，用Origin8.0进行绘图。

　　2结果与分析

　　2.1轮叶黑藻叶片对水体中TCS的吸收

　　由表1可见，实验周期内0.05～0.5mg·L-1TCS暴露下，轮叶黑藻叶片中均检测出不同浓度的TCS残留。暴露初期轮叶黑藻对TCS的富集能力较强，TCS暴露浓度为0.05mg·L-1时，轮叶黑藻叶片中的TCS含量为4.71μg·g-1，且随着TCS暴露浓度的增加，植物叶片中的TCS含量也随之增加。但是，当TCS暴露浓度为0.5mg·L-1时，植株生长受到TCS胁迫，轮叶黑藻对TCS的富集能力受到影响，其叶片中TCS的含量显著降低。TCS水体暴露14d时，轮叶黑藻叶片中TCS含量与暴露7d时相比呈下降趋势，3个浓度处理组分别降低了24.4%、27.6%和47%。随着TCS暴露时间的延长，在21、28d时，植株叶片中TCS含量逐渐升高，其中0.1mg·L-1TCS处理组中轮叶黑藻叶片中TCS的浓度最大。

　　2.2TCS对轮叶黑藻叶绿素含量的影响

　　由图2a可知，TCS暴露初期(7d)轮叶黑藻各处理组叶片中叶绿素含量与对照组相比显著降低，3个处理组的抑制率分别为68.01%、77.88%和70.36%。TCS暴露14d后，各处理组叶绿素含量有所回升，尤其是当TCS暴露浓度为0.05mg·L-1时，叶片中叶绿素含量比对照组高出30.06%，呈现显著的促进作用。随着暴露时间的延长，又出现抑制现象。暴露末期低浓度处理组叶片中叶绿素含量基本恢复到对照水平。

　　与叶片中叶绿素的变化情况相比，TCS对轮叶黑藻茎部的叶绿素含量的抑制作用显著降低。由图2b可知，暴露初期，TCS浓度与茎部叶绿素含量之间具有一定的剂量-效应关系。14、21d时，0.05mg·L-1TCS处理组中，茎部叶绿素含量有所回升，甚至呈现出激活效应，而0.1和0.5mg·L-1TCS处理组中轮叶黑藻茎部中的叶绿素含量仍然受到显著抑制，但是组间差异不显著。暴露末期，各处理组中茎部叶绿素含量均显著高于对照组，其中0.05mg·L-1TCS暴露28d后对茎部叶绿素的促进率可达45.1%。