初沉污泥中真菌群落结构与病原真菌组成研究

发布时间：2020-04-15

　　摘要：为调查初沉污泥的真菌多样性及其生物安全性，以郑州市某污水处理厂(活性污泥法)的初沉池污泥为研究对象，通过IlluminaMiSeq高通量测序技术，分析真菌群落组成和病原真菌的含量.chao1指数显示，该污水处理厂1a内初沉池污泥均显示出丰富的真菌多样性，并且冬季的真菌多样性略低于夏季的.PCA结果显示，1a内初沉池污泥的真菌群落没有明显的季节变化趋势.Ascomycota，Basidiomycota在四季初沉污泥中均是优势真菌门.除了Ascomycota，Basidiomycota外，Zygomycota，Glomeromycota也在不同季节的初沉污泥中检测到.在门水平上的未分类真菌在四季初沉污泥中的丰度都很高.属水平分析结果显示，Trichosporon，Candida在四季初沉污泥中均是优势真菌属.在初沉池污泥中发现Trichosporon.Loubieri，Candida.spp等病原真菌.为避免造成环境二次污染，初沉池污泥在排出前需进行处理.

　　关键词：市政污水处理厂;初沉污泥;高通量测序;真菌群落;病原真菌

　　活性污泥法是一种操作简单、成本低廉、处理效果好的污水处理工艺，被广泛应用于污水的处理[1—3].然而，该方法在处理污水的同时会产生大量的污泥，而污泥中常含有有机质、致病虫卵等污染物，如未经处理直接排入环境会造成二次污染[4—5].目前，对活性污泥法污水处理厂污泥的研究主要集中在生物反应池中污泥的微生物群落及病原菌组成上，而有关初沉污泥的微生物群落，尤其是初沉污泥真菌群落的研究较少.笔者以郑州市某市政污水处理厂(活性污泥法)的初沉池污泥为研究对象，用IllminaMiSeq测序法分析初沉污泥中真菌群落结构及病原真菌组成，以期为该类污水处理厂初沉污泥的处理和资源化研究提供参考.

　　1实验

　　1.1污泥样品的采集和理化性质测定

　　文中调查的污水处理厂是一个A2/O(anaerobic-anoxic-oxic，厌氧-缺氧-好氧)工艺的市政污水处理厂，位于河南省郑州市.初沉池位于A2/O生物反应池之前，具体工艺流程见图1，进厂污水被平均分配到6个平行的处理系统中.

　　采样时间为2014年7月至2015年4月.用便携式仪器测定污泥样品的温度和pH值.3个平行初沉池采集样品2份，分别放入便携式冰箱和液氮中迅速运回实验室.放入便携式冰箱的样品按污泥理化性质测定标准方法测定其化学需氧量(COD)[6]、溶解性化学需氧量(sCOD)、总氮(TN)、总磷(TP)、悬浮物(SS).放入液氮的样品保存于-80℃便于后续DNA的提取.

　　1.2DNA的提取

　　每个样品取10mL，用0.22μm的滤膜(MilliporeLtd.，Bedford，UK)过滤.用无菌剪刀把滤过污泥的滤膜剪成小条状，用FastDNASPIN试剂盒(MPBiomedicals，USA)提取基因组DNA.用NanodropND-1000微量核酸蛋白检测仪(NanodropThecnologies，USA)检测提取效果.基因组DNA保存于-80℃冰箱备用.每个样品提取3份并在后续实验前合并.

　　1.3IllminaMiSeq测序

　　在上机测序前，对样品DNA进行PCR扩增并建库.引物对ITS3，ITS4用于扩增真菌的ITS基因[7].用于每个样品PCR扩增的正向引物5’端均带有barcode，以便于测序后分析数据时识别样品的ID.按照实验条件进行PCR扩增，每个样本作3次重复.用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(Axygen，USA)切胶回收PCR产物.用NanoDropND-2000超微量分光光度计(ThermoScientific，Waltham，MA，USA)进行检测定量，并按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合.根据IlluminaMiSeq测序的说明书构建PE文库并加接头，由中国科学院成都生物所IlluminaMiSeq测序平台进行测序.

　　1.4数据分析

　　测序获得的原始序列由Trimmomatic进行剪切和过滤[8](设置50bp窗口，过滤尾部质量值小于20的碱基).在组装前，overlap的序列对(最小overlap长度为10bp，且overlap区允许的最大错配率为0.2)由FLASH(fastlengthadjustmentofshortreads)进行拼接[9].后续的分析均在QIIME平台上实现[10].去除嵌合体、OTU聚类(相似水平为97%)及分类学(GreenGenes，RDPII，NCBI，置信度为80%)信息比对均采用USEARCH算法[11].从生物分类学方面评估群落的多样性和相似性.进行多样性指数计算前，选取的序列数统一为所有样品中最小的序列.

　　2结果与讨论

　　2.1污泥的理化性质

　　除了温度，四季初沉污泥的其他理化性质均没有明显变化(表1).这是因为该污水处理厂的进水是市政污水，产生源在1a内没有明显变化.

　　2.2真菌的群落结构

　　用IlluminaMiSeq测序，读取4个样本的ITS测序数据.为在相同的测序深度上分析样品，每个样品统一取6210条有效序列(表2)，所有样品的覆盖度均超过90%，说明测序深度合理.初沉污泥中有丰富的真菌多样性(表2)，并且冬季初沉污泥的真菌多样性略低于夏季初沉污泥的.为反映不同样品中真菌群落组成的相似性，将各组样本之间的差异用PCA进行检测(图2).由图2可知，四季样品的真菌群落的差异不显著.同时，样品间的多样性分析表明，季节性初沉污泥的真菌群落结构相似.

　　在97%的相似度下对所有序列进行OTU(operationaltaxonomicunits)分类，从而进行生物信息学统计分析.在门水平上的相对丰度如图3所示.由图3可知，所有序列分属于4个真菌门.Ascomycota(29.36%～36.03%)和Basidiomycota(28.79%～33.02%)在四季初沉污泥中均是优势真菌门，且其丰度在1a内变化不显著.除了Ascomycota，Basidiomycota外，Zygomycota(0.4%～0.8%)，Glomeromycota(0.01%～0.1%)也在不同季节的初沉污泥中检测到，但是其丰度非常小.说明初沉污泥中主要真菌的丰度变化没有明显的季节变化趋势.这是由于大部分的真菌在生长发育过程中会形成菌丝，并依靠菌丝和孢子进行繁殖，这使它们的耐受性高于无菌丝结构的微生物.因此，在初沉污泥的温度变化范围内(10～25℃)，真菌群落的组成及其丰度变化不显著.

　　进一步在属的水平上分析初沉污泥中的真菌群落结构(图4).由图4可知，与在门水平上的结果相似，四季初沉污泥的真菌群在属水平上没有显著差异.Trichosporon(6.93%～9.57%)，Candida(3.42%～7.20%)和属于Tremellomycetes纲的未知属(1.15%～2.59%)在四季初沉污泥中的丰度占前3位.研究显示，Trichosporon，Candida在活性污泥中被检测到较高丰度，而且它们在污水处理中起着很重要的作用[12—13].因此，初沉池中的污水一定程度上为生物反应池提供了微生物种子.

　　值得关注的是，未分类真菌在四季初沉污泥中的丰度都很高，在门水平上的丰度为31.46%～41.06%.说明初沉污泥中有大量未知真菌，对初沉污泥中真菌的进一步研究有利于扩大真菌资源库.

　　2.3病原菌的组成

　　为进一步分析初沉污泥中的病原真菌信息，对四季样品的有效序列在病原真菌数据库中进行比对.结果表明，在1a内的初沉污泥中均发现病原真菌，且其丰度在四季初沉污泥中变化不明显.在初沉污泥中，丰度最高的病原真菌是能够引起毛孢子虫病的病原微生物Trichosporon.Loubieri[14—16].丰度第二的病原菌是能引起念珠菌病的Candida.spp[17—18].同时，除了Trichosporon.Loubieri，Candida.spp，还检测出其他病原真菌，如Cryptococcus.spp[19]，Aspergillus.spp[20]，但它们的丰度较低.

　　3结论

　　1)郑州市某市政污水处理厂(活性污泥法)初沉污泥的真菌群落没有表现出明显的季节性变化趋势.

　　2)Ascomycota(29.36%～36.03%)，Basidiomycota(28.79%～33.02%)在四季初沉污泥中均是优势真菌门，Trichosporon，Candida在四季初沉污泥中均是优势真菌属.

　　3)在1a内的初沉污泥中，发现Trichosporon.Loubieri，Candida.spp等病原真菌的存在.为避免造成环境二次污染，初沉池污泥在排入环境前需进行处理.

　　期刊推荐：《农业科学研究》(季刊)创刊于1980年，是由宁夏大学主办的农业类学术刊物，国内公开发行，以反映我院科研成果为主，集学术性、实用性于一刊，系大农业综合性刊物。主要刊登农学、林学、园艺、畜牧、兽医、农业经济、农田水利、草业科学、食品科学、生物科学及有关基础科学等方面的学术论文、研究报告、专题综述、应用技术及简报、简讯等。可供有关专业的教学、科研、农业技术管理人员、农业行政管理干部、有关企业人员和大专院校师生阅读参考。