共代谢基质对苯酚降解菌XTT一3降酚作用的影响
发布时间：2020-04-10
摘要采用驯化的方法从活性污泥中分离到一株苯酚降解菌XTT一3，经16SrDNA鉴定为Sphingobiumsp.。对该菌株进行碳饥饿处理，发现其降解苯酚的能力受到抑制。以只含苯酚的M9培养基为参照，添加0.2g/L酵母膏作为共代谢基质，对XTT-3菌株降解苯酚有较明显的促进作用，36h后苯酚降解率为68。在含0.2g/L酵母膏的M9培养基中，同时添加20mg/L邻苯二酚，XTT-3降解苯酚作用显著增加，24h后苯酚降解率达75，苯酚降解速度达0.261mg/min。
关键词苯酚生物降解Sphingobiumsp.共代谢碳饥饿
苯酚是重要的化工原料，也是典型的污染物，含苯酚的工业废水未经处理直接排放到环境中会对生态系统和人类造成严重威胁_】]。目前，国内外均有运用生物降解法降解苯酚及芳烃类化合物的报道，其中以筛选苯酚降解菌最常见[2]。本实验筛选到一株苯酚降解菌XTT一3，经16SrDNA鉴定为Sphingobiumsp.，继而开展了研究。
共代谢是一种很独特的代谢方式，某些有毒难降解物质不能被微生物直接降解，但添加某些易被微生物降解的物质如葡萄糖、乙醇等，则可以促进或启动难降解物质的降解，但是共代谢过程要求一级基质与二级基质保持合适的浓度比[5]。TIAN等[6]研究发现，添加100mg/L葡萄糖作为共代谢基质不能促进菲生物降解，添加50、100mg/L水杨酸也不能，而添加2Omg/L水杨酸具有一定的效果。当然，共代谢基质并不是影响难降解物质生物降解的主要因素，还与许多其他因素有关。本研究在保持其他因素(pH、温度、接种浓度)一致的条件下，考察了添加不同共代谢基质对苯酚降解的影响。
苯酚等芳烃类化合物生物降解的主要过程是首先在羟化酶作用下降解为邻苯二酚这一中间产物，继而诱导产生邻苯二酚1，2一双加氧酶或邻苯二酚2，3一双加氧酶，邻位或者间位裂解苯环后将其彻底降解]。由此，本研究在选择共代谢基质时特别添加邻苯二酚作为底物，观察其对苯酚降解的影响。
1材料与方法
1.1实验材
1.1.1菌种来源
取自上海龙华污水处理厂的活性污泥。
1.1.2培养基
(1)M9培养基：Na2HPO46g，KH2PO3g，NaC10.5g，NH4C11g，MgSO40.24g，CaC120.011g，FeSO40.025g，pH6.5～6.8，加去离子水定容至1L。
(2)营养琼脂培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaC15g，琼脂20g/L，加去离子水定容至1L，pH7.0，121℃灭菌15min。
(3)分离纯化培养基：无机盐培养基，加入20g/L琼脂，分别添加500、700、1000mg/L苯酚。
1.2实验方法
1.2.1苯酚降解菌的富集、分离与纯化
苯酚降解菌的富集在含有50mLM9培养基的250mL锥形瓶中进行。以梯度压力的方式驯化l_8]。活性污泥样品按10(体积分数)的接入量接种于含有500mg/L葡萄糖和300mg/L苯酚的M9培养基中，30℃摇床(2OOr/min)培养，在培养过程中每24h从培养液中取出5mL转入50mL新鲜的同种培养基中。驯化实验共转移了4次。培养过程中逐渐减少葡萄糖的质量浓度(200、0mg/L)，并增加苯酚的质量浓度(500、700、1000、1500rag/L)。总驯化时间为1周。
取0.1mL驯化培养液均匀涂布于分离纯化培养基平皿上，将平皿放于3O℃恒温培养箱中培养48h，挑取含有高浓度苯酚的平皿中的菌落，转接到营养琼脂培养基上划线分离1～2次至菌落纯化。
1.2.2XTT一3菌株的分子鉴定
细菌总DNA提取方法参照文献[9]。使用通用引物扩增片段长度约为1500bp的16SrDNA片段。取聚合酶链式反应(PCR)产物2L进行电泳，溴化乙锭(EB)染色后紫外检测。16SrDNA的纯化测序工作由北京六合华大基因科技股份(上海)有限公司完成。
1.2.3苯酚含量的测定
实验在含有50mL无菌M9培养基的250mL锥形瓶中摇床培养进行，平行做3组，取平均值为数据点;将活化的菌株用无菌M9培养基洗涤2次，并用新鲜的无菌M9培养基制成菌悬液(此时600nm处光密度值(OD。。。)一0.2)，30℃、自然pH下，按2(体积分数)接种量接入含500mg/L苯酚的无菌M9培养基中，以不接种的M9培养基作为空白参照。苯酚含量采用4一氨基安替比林法r1测定，苯酚降解率(R，)由式(1)计算：
R一(A。一As)/Ao×100(1)
式中：A。为不接种的空白参照中苯酚的质量浓度，mg/I;A为接过菌种的待测样液中苯酚的质量浓度，mg/L。
2结果与讨论
2.1细菌的富集、分离与纯化
本实验筛选获得9株菌，经过单菌验证均能在含苯酚的培养基中生长，其中有1株菌生长显著，将·4O。其命名为XTT一3。
2.2菌种的鉴定
XTT一3菌株的电镜照片见图1。该菌株菌落呈黄色，不透明，边缘整齐，革兰氏染色为阴性，不水解淀粉、油脂。其16SrDNA的部分序列递交至GenBank(登录号为JN120899)，进行在线BLAST分析比对。结果表明，XTT一3菌株的16SrDNA序列与Sphingobiumsp.的16SrDNA序列同源性为100，综合其形态特征、生理生化及电镜下的形态，鉴定该菌为Sphingobiumsp.。利用MEGA5.0软件构建系统发育树，如图2所示。
2.3碳饥饿实验
将新鲜制备的XTT-3菌悬液(OD。。一0.2)作为非饥饿细胞直接接种到含500mg/L苯酚的M9培养基中作为对照。制备碳饥饿细胞，取细胞悬浮液(OD。。一0.2)在30℃、250r/min下，在不含苯酚的M9培养基中培养48h，而后于室温下静置24h。然后，在M9培养基中添加500mg/L苯酚供给碳饥饿细胞，在一定时间取样测定，比较上述2种细胞的苯酚降解能力。如图3所示，碳饥饿的菌株细胞降解苯酚的能力受到抑制。与文献[11]报道的碳饥饿处理过的SA01细胞的苯酚降解速度比非饥饿细胞快的结论不同。
2.4共代谢实验
在仅含苯酚的M9培养基和分别添加了0.2g/L共代谢基质(酵母膏、葡萄糖、蔗糖、邻苯二酚、水杨酸)的M9培养基中，分别接入菌株，培养36h后取出，考察共代谢基质对苯酚降解的影响。如图4所示，添加酵母膏能较明显促进苯酚降解，36h后苯酚降解率为68，而添加葡萄糖、蔗糖等效果不显著。这说明并非所有共代谢基质的加入都能获得较高的共代谢率。在培养过程中，观测到添加邻苯二酚的M9培养基颜色逐渐变为锈红色，而且维持了较长一段时间，而后和其他摇瓶一样逐渐变为黄色(2一羟基粘糠酸半醛)。这说明邻苯二酚有一个较长时间的氧化过程，之后才开始降解苯酚。在M9培养基中添加少量的邻苯二酚(20、40mg/L)，与仅含苯酚的M9培养基及添加了0.2g/L酵母膏的M9培养基一起，分别接入菌株，培养36h后观察苯酚降解情况。如图5所示，少量邻苯二酚的添加对苯酚降解也没有明显促进作用。
在含0.2g/L酵母膏的M9培养基中，分别添加不同质量浓度的邻苯二酚，再接入XTT一3菌株，培养24h后观察苯酚降解情况。如图6所示，除添加1mg/L邻苯二酚对苯酚降解没有显著促进作用外，添加5～100mg/L邻苯二酚对苯酚降解均有一定的促进作用，其中添加20mg/L邻苯二酚效果最好，在24h后苯酚降解率达75。这可能是因为酵母膏的添加促进了菌体的生长，同时补充以适量的底物邻苯二酚以诱导出苯酚降解酶，从而加快了苯酚的降解。由表1可见，在含0.2g/L酵母膏的M9培养基中添加20mg/L邻苯二酚，培养24h后XTT-3菌株对苯酚的降解速度最大，达0.261mg/min。
3结论
(1)从污水处理厂的活性污泥中通过驯化法筛选分离得到一株苯酚降解菌XTT一3，经形态特征、生理生化及16SrDNA鉴定，该菌为Sphingobiumsp.o
(2)该菌株细胞经碳饥饿处理后降解苯酚能力受抑制。在其他因素(pH、温度、接种浓度)一致的条件下，以苯酚作为唯一碳源，XTT一3菌株降解苯酚十分缓慢，添加0.2g/L酵母膏作为共代谢基质一定程度上促进了苯酚降解。而在M9培养基中同时添加0.2g/L酵母膏和20mg/L邻苯二酚能显著加快苯酚降解，在24h后苯酚降解率达759/6，降解速度达0.261rag/rain。
(3)采用同时添加2种共代谢基质以加快苯酚生物降解的方法目前鲜见报道，较常规添加单一辅助基质的方法大大提高了苯酚的降解速度。
共代谢基质对苯酚降解菌XTT一3降酚作用的影响相关期刊推荐：《环境污染与防治》(月刊)创刊于1979年，由浙江省环境保护科学设计研究院主佃。刊登有关环境污染防治技术的研究报告和综述等学术文章，交流各级政府部门及企事业单位环境管理经验，报道国内外环境保护的新动态”。有投稿需求的作者，可以咨询在线编辑老师。
