GSK3抑制剂氯化锂对FMR1基因敲除小鼠的自主活动的干预作用
发布时间：2020-04-02
摘要目的：探讨GSK3抑制剂氯化锂对FMR1基因敲除小鼠的自主活动的干预作用及机制方法：通过对90只30日龄FMR1基因敲除小鼠连续腹腔注射不同剂量氯化锂5d，行自主活动行为学实验.观察能否改善KO鼠的过度活动的表型;同时利用免疫印迹技术检测KO及wT鼠的海马和皮层的GSK3[3和P—GSK313的变化。结果：在自主活动行为学实验中，KO鼠的活动次数比wT鼠的活动次数增多而站立次数比wT鼠减少，差异具有统计学意义(P<0.05);使用氯化锂后。KO鼠的活动次数明显减少及站立次数明显增多，差异均有统计学意义(P<0.05);免疫印迹实验结果：KO鼠P—GSK3[3表达比wT鼠少。用氯化锂后.KO鼠P—GSK313的表达增多。KO鼠和wT鼠使用氯化锂后，总的GSK3[3无明显改变(P>0.05)。结论：GSK3[3的抑制剂氯化锂能改善KO鼠的活动过度的表型，可能与氯化锂导致的PGSK3[3的表达增加有关.对FMR1基因敲除小鼠有治疗作用。
关键词脆性x综合征;自主活动;磷酸化GSK3[3;氯化锂：FMR1基因敲除
脆性x综合征(FXS)是常见的遗传性智力低下疾病之一，FMR1(fragileXmentalretardation1)基因敲除小鼠与FXS患者有很多相似的症状.包括不同程度的活动过度，焦虑伴情绪波动等…。因此，FMR1基因敲除小鼠是研究FXS的一个较好的动物模型。锂可能直接或间接抑制GSK3(glycogensynthasekinase3)的活性l2]，提示GSK3可能是锂治疗FXS的一个作用靶点。本实验观察FMR1基因敲除小鼠使用氯化锂前后的探索行为，同时观察小鼠脑区GSK3[3(glycogensynthasekinase3J3)和P—GSK3~(phosphorylatedglycogensynthasekinase3J3)表达情况，探讨GSK3抑捌剂氯化锂是否能改善KO小鼠的过度活动行为及其机制。
1材料与方法
1.1实验动物及处理FMR1基因敲除型(KO)纯合子(一/一)及其野生型(WT)纯合子(+/+)FVB近交系小鼠由荷兰伊拉斯塔斯大学细胞生物学及遗传学研究中心OostraBA教授惠赠。广州医学院实验动物中心饲养及繁殖。实验动物选用30日龄，分为KO和WT两大组，每大组又分为：生理盐水(Ns)组、30mg/kg组、60mg/kg组、90mg/kg组、120mg/kg组、200mg/kg组，每小组均为l5只。所有小鼠使用前做基因鉴定;每窝小鼠均随机分成上述6组;小鼠连续5d腹腔注射氯化锂(Sigma)，第5天给药30min后做自主活动实验。第6天给药30min后取脑组织，所有行为学实验均在上午9：O0～12：00进行。
1.2实验动物的基因型鉴定参照文献『3]。
1.3自主活动实验小鼠自主活动测试仪(成都泰盟科技开发公司)：定时为5min，将小鼠分别放入每个反应槽.盖上盖子后开始进行实验。当小鼠站立时，反应槽周围上方的红外线探头探测到信号改变，当小鼠没有站立，而是在爬行时，反应槽周围下方的红外线探头探测到信号改变，数据均自动记录。实验结束后，打印实验数据。
1.4组织制备及蛋白免疫印迹小鼠第6天给药30min后，脱臼断头取脑，冰上分离取大脑皮层和海马。蛋白样品的制备及蛋白免疫印迹检测参考文献[4]，免疫印迹用光密度法定量。
1.5统计学分析所有结果均用±s表示，用SPSS17.0统计软件分析;实验结果KO与wT鼠比较用独立样本t检验，KO或wT鼠5种用药剂量间比较采用单因素方差分析，所有的检验P<0.05具有统计学意义。
2结果
2.1小鼠基因型鉴定结果KO鼠和WT鼠分别扩增出约800bp和468bp的DNA片段。
2.2自主活动实验结果见表1及表2。
2.3免疫印迹实验结果见图1～6。
3讨论
FXS目前尚无有效的治疗方法。近些年有研究提出锂可能对FXS有治疗作用[，其作用机理可能是对GSK3的抑制.人们对锂的药物代谢动力学和安全性都有了较深的了解E2]，但在FXS小鼠模型中使用锂剂后GSK3活性改变与KO鼠表型的变化的关系有待进一步验证。
本实验对30d龄的KO与wT鼠进行自主活动观察，发现KO鼠活动次数比wT鼠多，而站立次数比wT鼠少.差异均有统计学意义，表明KO鼠的活动性增加.运动能力强。与Liu等[6]的研究一致。提示KO鼠对新环境的认知能力差，对危险情况意识下降，焦虑反应减少。
KO鼠5个用药剂量组与Ns组比较，其中90mg/kg组、120mg/kg组及200mg/kg组活动次数减少，站立次数增加，差异有统计学意义(P<0.05)，说明氯化锂能降低KO鼠的活动过度这一特性。wT鼠用药后，与Ns组比较，其中200mg/kg组活动次数减少，120mg/kg组及200mg/kg组站立次数增加，差异有统计学意义(P<0.05)，锂对WT鼠的活动性是否有影响。尚不能确定，Yuskaitis等7l的研究认为锂对WT鼠在旷场行为中的活动性没有明显的作用.证明锂对小鼠活动性的降低是FXS小鼠特有的，所以我们考虑200mg/kg剂量组对wT鼠活动性的降低不排除是由于锂的镇静作用所致。
蛋白免疫印迹结果显示，在NS组小鼠的皮层和海马.KO鼠的蛋白P.GSK3[3表达量比WT鼠少(P<0.05)(图2);KO鼠皮层和海马的GSK3~表达量与WT鼠比较无明显差异(P>0.05)(图1)。结果证实KO鼠P—GSK3[3表达量减少。进一步验证了在FVBFMR，KO鼠的皮质和海马，由于GSK3丝氨酸磷酸化减少，而导致GSK3的抑制性调节异常。为锂作为潜在治疗提供依据。
KO和wT鼠腹腔注射氯化锂6d后，发现能增加KO鼠皮层和海马的P.GSK3[3的表达量;对总的GSK3[3表达量改变不明显(图3及图4)。图5、6显示WT鼠用氯化锂后皮层和海马的P—GSK313及总的GSK3[3的表达量与NS组比较，表达量改变不明显。这些结果显示锂治疗能增加KO鼠脑区磷酸化的GSK3[3。
锂治疗能恢复KO鼠的高活动性缺陷，提示KO鼠的高活动性缺陷与KO鼠的GSK3的高活性是有关的。而且KO鼠的高活动性可能是通过锂剂增加脑内P—GSK3~水平而得到改善。总之，我们的研究表明锂剂能修复KO鼠受损的P.GSK3~，对KO鼠的过度活动有改善作用。锂可能对FXS患者有治疗作用。
GSK3抑制剂氯化锂对FMR1基因敲除小鼠的自主活动的干预作用相关期刊推荐：《中国实验动物学报》(双月刊)1993年创刊，是由中国实验动物学会主办并发行的国家级学术期刊。主要刊载有关实验动物和动物实验的理论专著、科研成果论文、科学实验新方法、新材料、实验动物新资源开发、新的动物品系的培育和应用以及与实验动物相关的其他学科的科学论述。读者对象：农牧渔业、医学、药学、环保、生物、体育、国防等单位的科技工作者、教育工作者、管理人员以及有关的生产者、大专院校学生等。
