醒脑再造胶囊对甲醛致小鼠记忆损害的影响
发布时间：2020-03-20
【摘要】目的探讨醒脑再造胶囊对甲醛所致小鼠记忆损害的影响及其作用机制。方法将SPF级KM小鼠随机分为空白对照组，溶剂对照组和低、中、高剂量组5组，每组14只，将除空白对照组以外的4组小鼠分别置于甲醛染毒装置中进行染毒，持续14d。通过避暗实验检测各组小鼠的学习记忆能力;采用生化方法测定脑组织中一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)活力以及丙二醛(MDA)水平;采用苏木素-伊红染色法观察小鼠海马CAl区锥体细胞的数目及形态结构变化。结果与空白对照组比较，溶剂对照组小鼠避暗潜伏期缩短(P<0.01)，错误次数增加(P<0.01)，脑组织中NOS和SOD活力降低(P<0.05)，MDA水平升高(P<0.01)，海马CA1区锥体细胞数目减少，排列稀疏紊乱，形态不规则。与溶剂对照组比较，中、高剂量组小鼠潜伏期均延长(P<0.05)，NOS和SOD活力均升高(P<0.01)，低、中、高剂量组小鼠错误次数均减少(P<0.05)，MDA水平均降低(P<0.01)。低、中剂量组小鼠海马CA1区锥体细胞层数略有增多，高剂量组海马CA1区锥体细胞层次清楚，排列紧密，数量明显增多。结论醒脑再造胶囊可改善甲醛所致的小鼠记忆损害，其机制可能与其抗氧化损伤作用及增加海马CA1区锥体细胞的数目有关。
【关键词】醒脑再造胶囊;甲醛;一氧化氮合酶;超氧化物歧化酶;丙二醛;海马;小鼠
甲醛是一种广泛存在的空气污染物，主要来源除了化工业生产外，还有不合格的装修材料和室内燃气等[1]。有研究显示，1990—2012年我国各个城市住宅进行装饰装修时室内甲醛污染情况较为严重[2]。甲醛不仅具有神经毒性、遗传毒性和致癌作用，还可对免疫系统和生殖系统产生毒性[3]，亦可导致哮喘[4]。其可降低DNA甲基转移酶的活力，从而损害健康成年大鼠的空间记忆[5]。长时间暴露于甲醛环境中可对神经化学物质的产生、释放、突触结合等环节造成直接干扰或伤害，使人或动物的认知、记忆和行为发生异常改变[6]。醒脑再造胶囊主要由石菖蒲、胆南星、僵蚕等组成，具有化痰醒脑、祛风活络、醒脑益智的功能，临床上主要用于患者神志不清、语言蹇涩、口角流涎、肾虚痿痹、筋骨酸痛、手足拘挛、半身不遂以及脑血栓的恢复期和后遗症等治疗[7]。关于醒脑再造胶囊能否改善甲醛所致小鼠记忆损害尚未见报道。本研究首先通过避暗实验观察醒脑再造胶囊是否对甲醛所致小鼠记忆损害具有保护作用，再进一步采用生物化学方法检测小鼠脑组织匀浆中的一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，NOS)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)活力以及丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平，并观察小鼠海马CA1区锥体细胞的数目和形态结构的变化，以初步探讨醒脑再造胶囊对甲醛致小鼠记忆损害的作用机制。
1材料和方法
1.1实验动物
SPF级KM小鼠70只，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供[SCXK(鲁)2014-0007]，雌雄各半，体质量16～18g，4周龄。小鼠饲养于徐州医科大学麻醉学院机能学实验室屏障设施中[SYXK(苏)2016-0028]，分笼饲养，每笼5只，自由摄食及饮水。并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。本研究经徐州医科大学实验动物伦理委员会审查批准(IACUC审查号:2017062502)。
1.2主要试剂与仪器
醒脑再造胶囊(西安大唐制药集团有限公司)，用0.9%氯化钠溶液配制成混悬液，每次用毕于4℃条件下保存;质量分数为37.0%～40.0%甲醛溶液(分析纯，上海中秦化学试剂有限公司);NOS、SOD、MDA检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白浓度检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。ZH-600型避暗仪(安徽正华生物仪器设备有限公司);MultiskanTMGO全波长酶标仪(美国赛默飞世尔科技公司);752紫外光栅分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。
1.3实验方法
1.3.1动物分组与处理
小鼠经适应性饲养1周后，按性别将其1∶1随机分为空白对照组、溶剂对照组和低、中、高剂量组，每组14只。低、中、高剂量组分别予剂量为1.0、1.5、2.0g/kg体质量的醒脑再造胶囊混悬液灌胃，每次灌胃前将混悬液震荡摇匀，灌胃容积均为20mL/kg，空白对照组和溶剂对照组小鼠予等体积0.9%氯化钠溶液灌胃。建立甲醛染毒装置:制作4个60cm×40cm×50cm的纸箱，于每个纸箱的4个角落各放置1个直径6cm、高5cm的杯子，每个杯子每天均加入10mL质量分数为37.0%～40.0%的甲醛溶液，造成一个甲醛超标的环境，将除空白对照组以外的4组小鼠分别置于上述装置中进行甲醛染毒，并将纸箱封口，2h后将小鼠取出[8]。每天上午8:30～9:30进行灌胃，9:30～11:30进行甲醛染毒，持续14d。在染毒时段内，小鼠禁食禁水，其余时间自由进食和饮水。
1.3.2避暗实验
于实验第13天甲醛染毒结束后，从每组小鼠中各随机选取10只进行避暗实验。训练时先将小鼠放入避暗反应箱中适应3min，再在暗室底部铜栅通以0.2mA、50Hz交流电，将小鼠背对洞口放入明室，小鼠进入暗室即受电击，立即取出小鼠;24h后将小鼠再次放入明室，记录其第1次进入暗室所需的时间(即避暗潜伏期)和5min内进入暗室的次数(即错误次数)。若5min内小鼠未进入暗室，错误次数记为0，潜伏期记为300s。
1.3.3脑组织匀浆中NOS、SOD、MDA检测
避暗实验结束后，将小鼠迅速断头处死，剥离脑组织，取双侧大脑半球，分离除去嗅球、脑干，准确称质量，在冰上按质量体积比加0.9%氯化钠溶液制成10.0%的脑组织匀浆，在4℃下以2500r/min离心15min，取上清液置于-20℃冰箱中保存。根据试剂盒说明书，在波长530nm，1cm光径下测定吸光度值，检测每只小鼠脑组织匀浆中NOS、SOD活力以及MDA水平。
1.3.4海马CA1区病理组织学检查
将各组其余的4只小鼠断头处死，分离脑组织放置于质量分数为10.0%甲醛溶液中固定，选取双侧海马进行石蜡包埋、切片(厚度为5μm)、苏木素伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色，光学显微镜下观察海马CAl区锥体细胞的数目及形态结构的变化。
1.4统计学方法
采用SPSS19.0软件进行统计分析。实验结果均以平均数±标准差(x±s珋)表示，多组组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，P<0.05为差异有显著性。
2结果
2.1避暗实验结果与空白对照组比较，溶剂对照组小鼠潜伏期缩短(P<0.01)，错误次数增加(P<0.01)，表明甲醛可对小鼠的
记忆造成损害。与溶剂对照组比较，中、高剂量组小鼠潜伏期均延长(P<0.05)，低、中、高剂量组小鼠错误次数均减少(P<0.05)。见表1。
2.2脑组织匀浆中NOS、SOD、MDA检测结果
与空白对照组比较，溶剂对照组小鼠NOS和SOD活力均降低(P<0.05)，MDA水平升高(P<0.01)。与溶剂对照组比较，中、高剂量组小鼠NOS和SOD活力均升高(P<0.01)，低、中、高剂量组小鼠MDA水平均降低(P<0.01)。见表2。
2.3海马CA1区病理组织学检查结果
空白对照组海马CAl区锥体细胞有3～5层，层次清楚，排列整齐紧密，染色均匀;细胞呈圆形或椭圆形，形态结构完整，核仁清晰(图1A)。溶剂对照组CA1区锥体细胞层次变薄，为1～3层;细胞排列稀疏紊乱，数量减少，部分细胞形态不规则，胞体有不同程度的缩小，胞质深染，可见核碎裂、核溶解现象，灶性区域可见炎细胞浸润(图1B)。低、中剂量组海马CA1区锥体细胞层数减少，细胞疏松，胞质浓染，但较溶剂对照组排列整齐，且细胞层数较溶剂对照组增多，达3～4层，但依旧可见核溶解以及炎细胞浸润(图1C、1D)。高剂量组海马CA1区锥体细胞排列为3～5层，层次清楚，细胞数量较溶剂对照组和低、中剂量组增多，排列较紧密，着色均匀，胞浆深染的神经细胞少见(图1E)。
3讨论
甲醛是一种常见的环境污染物，甲醛暴露可引起多种病理表现[9]，其在机体认知障碍的发生发展过程中亦起重要作用。有研究发现，甲醛引起的脑代谢和氧化应激改变，可能与神经退行性疾病的病理进展有关[10]。大鼠经侧脑室注射甲醛染毒可损伤其在Morris水迷宫中的学习记忆能力和对新物体识别能力，并促进海马细胞凋亡和脂质过氧化的形成[11]。而吸入甲醛可导致动物记忆丧失和人类认知衰退[12]。既往本实验室研究发现，在避暗实验中，甲醛染毒可使小鼠的潜伏期缩短，错误次数增多，表明对小鼠的学习记忆能力造成了一定程度的损害[8]。避暗实验是根据啮齿类动物趋暗避明的习性设计，一半是暗室，一半是明室，中间有一小门相连;暗室底部铺有通电的铜栅，动物进入暗室即受到电击。以潜伏期和错误次数作为指标，动物间差异较小，该实验简单易行，敏感性较高，是检测学习记忆能力的经典方法之一[13-14]。因此，本研究采用避暗实验观察小鼠的记忆能力。
本研究结果证实，与空白对照组比较，溶剂对照组小鼠避暗潜伏期缩短，错误次数增加，差异有显著性，其表现主要体现为学习记忆功能的损害，为下一步的实验奠定了可靠的模型基础。而与溶剂对照组比较，中、高剂量组潜伏期均延长，低、中、高剂量组错误次数均减少，差异有显著性，说明预先给予醒脑再造胶囊对甲醛所致小鼠记忆损害有保护作用。
SOD是体内天然存在的氧自由基清除剂，具有清除并阻止由氧自由基引发的自由基连锁反应的作用，其活力高低可作为评价机体清除氧自由基能力的指标[15];MDA则是体内脂质过氧化的主要代谢产物，其水平高低可作为机体细胞受自由基攻击程度的指标[16]。有研究证实，小鼠若长时间吸入甲醛，会导致脑组织中SOD活力降低，MDA水平升高[17]。适量的一氧化氮可清除自由基，调节脑血流量，加强学习记忆能力[18]，且对长时程增强作用(long-termpotentiation，LTP)的形成和建立有重要作用。NOS是催化生成一氧化氮的关键酶[19]，当NOS活力降低，一氧化氮生成不足，机体清除自由基的作用即减弱，LTP的形成和突触可塑性的建立亦受到影响，从而影响学习记忆能力。本研究发现，与空白对照组比较，溶剂对照组小鼠NOS和SOD活力均降低，MDA水平升高，差异有显著性，说明甲醛可促进脂质过氧化的形成。与溶剂对照组比较，中、高剂量组小鼠NOS和SOD活力均升高，低、中、高剂量组小鼠MDA水平均降低，差异有显著性，因此我们推测预先给予醒脑再造胶囊对小鼠记忆损害的保护作用可能与其抗氧化损伤作用有关。
醒脑再造胶囊的主要成分为石菖蒲[20]，石菖蒲为天南星科多年生草本植物石菖蒲的干燥根茎，具有抗痴呆、改善记忆、抗抑郁、抗惊厥和抗癫痫的药理作用[21]。有研究发现，石菖蒲水提取物可增强小鼠的学习记忆能力，提高脑组织SOD活力，降低MDA水平[22]。Mao等[23]研究表明，石菖蒲及其活性成分细辛醚可通过调控细胞外调节蛋白激酶的级联反应，直接促进神经干细胞增殖和神经发生。本研究中预先给予醒脑再造胶囊对甲醛所致小鼠记忆损害具有保护作用，可能与其主要成分石菖蒲密切相关，与其他成分的关系尚有待进一步研究。海马不仅与多种神经性和精神性疾病相关，且与空间学习记忆密切相关[24]，其结构中与学习记忆关系最为密切的是CA1功能区[25]。本研究中，溶剂对照组小鼠海马CA1功能区锥体细胞层次变薄，细胞排列稀疏紊乱，可见核碎裂、核溶解现象，可能是甲醛致小鼠记忆损害的病理学基础。预先给予醒脑再造胶囊可显著增加甲醛小鼠海马CA1区锥体细胞数量，减少锥体细胞凋亡。可见，醒脑再造胶囊通过有效保护海马CA1区的神经锥体细胞，从而对甲醛致小鼠记忆损害有改善作用。
综上所述，醒脑再造胶囊可改善甲醛所致的小鼠记忆损害，其机制可能与其抗氧化损伤作用及增加海马CA1区锥体细胞数目有关。本研究可为临床工作中选择防治甲醛所致记忆损害的药物提供实验依据。有研究表明，甲醛可通过降低小鼠脑内脑源性神经营养因子水平引起小鼠学习记忆障碍[26]，还可影响未发育成熟大鼠海马CA3区钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ表达，降低其空间学习记忆能力[27]。醒脑再造胶囊对甲醛所致小鼠记忆损害的保护作用是否与这两项指标有关，尚待进一步研究。
