过表达P75神经生长因子受体负向调控骨髓间充质干细胞的成骨分化

发布时间：2020-03-04

　　摘要背景：P75NTR广泛表达于神经组织及细胞中，并发挥着促进或抑制分化的双重作用;同时在骨折不愈合局部组织中也发现了P75NTR存在着过表达，因此研究P75NTR对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用具有重要的意义，为临床上提高骨折不愈合修复的疗效提供重要靶点。目的：观察P75NTR过表达对大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导成骨分化的影响。方法：选取SD大鼠双侧股骨，用全骨髓分离贴壁法提取大鼠骨髓间充质干细胞并进行体外传代培养;构建表达EGFP的P75NTR过表达质粒GV358-P75NTR，并用空慢病毒载体包装收集P75NTR过表达慢病毒载体;选取体外培养至原代10d的大鼠骨髓间充质干细胞，消化后种板，加入P75NTR过表达慢病毒及相关感染试剂进行感染实验，感染7d后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，Westernblot检测P75NTR蛋白的过表达情况;感染后用常规培养基培养7d，更换成骨诱导分化培养基培养，诱导培养后第7，10，14天用酶标法定量检测碱性磷酸酶活力，诱导培养后第7，14天用茜素红染色观察矿化结节形成情况。结果与结论：①P75NTR过表达慢病毒感染骨髓间充质干细胞后能表达出绿色荧光蛋白(感染效率约90%)，且P75NTR蛋白表达量明显增多，与阴性病毒对照组比较差异有显著性意义(P<0.05)，过表达P75NTR细胞模型构建成功;②与阴性病毒对照组及未转染组相比，P75NTR过表达组细胞诱导分化后相应时间点的碱性磷酸酶活力明显降低，矿化结节形成减少，细胞聚集分布减弱，差异有显著性意义(P<0.05);③结果表明，P75NTR过表达负向调控了大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化。局部组织中P75NTR过表达抑制周围骨髓间充质干细胞成骨分化可能是骨缺损或骨折不愈合的重要因素。

　　关键词：P75神经生长因子受体;骨髓间充质干细胞;成骨分化;慢病毒;碱性磷酸酶;国家自然科学基金

　　0引言Introduction

　　P75神经营养因子受体(P75neurotrophinreceptor，P75NTR)是神经营养素的低亲和力受体，也是其他神经营养因子的受体，其结构复杂，主要包含3个区域，分别是胞外区、跨膜区、胞内区[1-2]。P75NTR在不同构象状态下可以通过不同的信号通路介导不同的效应，甚至可以是截然相反的生物学效应[3-4]。许多研究已证实P75NTR广泛存在于正常或者损伤后的组织及细胞中，发挥着不同的生物学作用[5-10]，同时P75NTR在某些多能干细胞中也有表达，并且对这些干细胞分化、增殖以及凋亡都有着相应的影响。

　　体外分离培养的骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)在一定诱导条件下可以分化为成骨细胞，同时P75NTR也是骨髓间充质干细胞的标志物之一，但是P75NTR在骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用和功能知之甚少。李家勇等[11]在骨折不愈合模型构建过程中发现了骨折不愈合后局部组织中P75NTR存在着过表达。王铭[12]也在一项研究中证实了骨折不愈合形成过程中，P75NTR表达持续增加，并且最后停留在一个高表达水平。骨折不愈合修复主要靠骨髓间充质干细胞定向成骨分化，以新生的骨组织填充缺损区，通过应力塑形完成骨缺损不愈合的修复。因此，作者以此为背景展开进一步研究，通过高效率的慢病毒感染方法将目的基因P75NTR感染进大鼠骨髓间充质干细胞[13]，构建P75NTR过表达细胞模型，体外诱导成骨分化后检测其成骨效应，观察P75NTR过表达对大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导成骨分化的影响，初步阐明局部组织中P75NTR过表达加速骨折不愈合形成的关键机制，为将来临床如何提高骨折不愈合修复的疗效提供重要的靶点。

　　1材料和方法Materialsandmethods

　　1.1设计完全随机设计方法。

　　1.2时间及地点实验于2018年7月至2019年3月在桂林医学院科学实验中心完成。

　　1.3材料

　　1.3.1实验主要试剂无酚红胰蛋白酶、青链霉素、Glycine、Tris、RIPA裂解液、PMSF、30%丙烯酰胺、SDS、TEMED、过硫酸铵、一抗稀释液、PVDF膜(索莱宝公司);过表达质粒GV358-P75NTR、慢病毒空载体、293T细胞、辅助质粒(Helper1.0和Helper2.0)、HitransGP(吉凯基因);RIPA裂解液、增强型BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天);成骨分化诱导基础培养基、诱导分化专用血清、青链霉素、谷氨酰胺、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松(Cyagen赛业生物科技);LodingBuffer、低糖DMEM/F12、彩虹Marker(赛默飞世尔科技);兔抗P75NTR单克隆抗体[ab52987](Abcam);GAPDH、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(中杉金桥);超敏发光液(Bridgen);微量酶标法碱性磷酸酶检测试剂盒(南京建成生物);茜素红S染色液(Cyagen赛业生物科技)。

　　1.3.2实验主要仪器凝胶成像分析系统、垂直电泳-转膜系统(美国Bio-Rad);普通光学倒置相差显微镜(德国蔡司公司);荧光倒置相差显微镜(日本奥林巴斯);滤光片型酶标仪、光栅型连续波长酶标仪(瑞士Tecan公司);气套式CO2培养箱、冷冻高速离心机(美国Thermo公司);非接触式全自动超声破碎仪(比利时DiagenodeSA公司);单通道移液器(Eppendorf公司);多通道移液器(美国Thermo公司)。

　　1.3.3实验动物SPF级SD大鼠4只，3月龄，体质量(250±30)g，雌雄不限，由斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2016-0002。

　　1.4实验方法

　　1.4.1大鼠骨髓间充质干细胞的提取、培养及鉴定SD大鼠用脊椎脱臼法处死后立即浸泡在体积分数为75%乙醇中15min，置于相对无菌操作台上解剖出大鼠双侧股骨，分离并剔除股骨周围附着的软组织，将提取的双侧股骨置于培养皿中，移至超净台上，加入含体积分数为10%胎牛血清及1%青链霉素的低糖DMEM/F12培养基6mL，用无菌注射器吸取适量培养基从股骨干骺端吹打出全骨髓，吹打10min后用灭菌滤网过滤弃杂质，用巴氏管将滤网下液体移至15mL离心管中离心(1000r/min，5min)，弃上清，加入含体积分数为10%胎牛血清及1%青链霉素的低糖DMEM/F12完全培养基吹匀后移至培养皿中，置入CO2培养箱中按常规培养，48h后半量换液，72h后全量换液，以后每3d全量换液1次，每次换液后光学倒置显微镜下观察细胞生长状态，培养至细胞融合度约80%时进行传代培养。吸净培养皿中培养基，PBS洗2次，加入胰蛋白酶3mL，置入培养箱中消化3min，加入完全培养基3mL终止消化，用1mL移液器沿着皿壁吹打后，将含细胞的液体移至15mL离心管中离心(1000r/min，5min)，弃上清，加入完全培养基吹匀后分装移至2个培养皿中，置入CO2培养箱中按常规培养，每3d全量换液1次。用倒置显微镜观察细胞生长状态及形态。

　　1.4.2P75NTR过表达慢病毒的构建及滴度检测配置质粒转染体系：Helper1.0、Helper2.0辅助质粒各15µg，GV358-P75NTR质粒20µg，慢病毒空载体，加入转染试剂使总体系体积为1mL。室温下放置10min后缓慢加到含293T细胞的培养液中，置于CO2培养箱中常规培养6h后全量换液，72h后收集细胞上清液至离心管中离心(4℃、25000r/min、2h)，弃上清，加入慢病毒保存液吹匀后收集慢病毒至保存管中，并用定量qPCR法检测滴度。

　　1.4.3P75NTR过表达慢病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞实验分3组：①未转染组：正常细胞未转染组;②阴性病毒对照组：阴性病毒转染对照组;③P75NTR过表达组：P75NTR过表达慢病毒感染组。感染：①第1天：将培养至12d的大鼠原代骨髓间充质干细胞用胰蛋白酶消化后离心，加入2mL完全培养基重悬后用细胞血球计数板计算细胞浓度，加入完全培养基将细胞稀释至浓度为5×107L-1，待后续种板用。取6孔板每孔加入2mL以上含细胞的培养液，摇匀后置于CO2培养箱中常规培养24h(细胞融合度20%-30%);②第2天：种板培养24h后，吸尽6孔板中的培养基，每孔加入1mL常规培养基，同时缓慢加入慢病毒4µL(按MOI=80计算所得)、HitransGP感染增强液40µL，轻柔振荡摇匀后置于CO2培养箱中常规培养;③第3天：感染后培养12h全量更换完全培养基。继续培养1周，待细胞长至融合度为60%-70%。

　　1.4.4体外诱导成骨分化培养无菌条件下配置成骨分化诱导培养基[具体配方：分化基础培养基(α-MEM培养基)175mL、诱导分化专用血清20mL、双抗2mL、谷氨酰胺2mL、β-甘油磷酸钠2mL、抗坏血酸400µL、地塞米松20µL]，配置前将血清置于4℃冰箱中解冻过夜，使用前30min室温溶解抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、双抗及谷氨酰胺，将以上物质及血清摇匀后全部加入分化基础培养基(α-MEM培养基)中，最后加入地塞米松混匀(地塞米松在使用前10min室温溶解)，配置好的成骨分化诱导培养基置于4℃冰箱中用于后续实验。取上述1.4.3步骤中融合度60%-70%的细胞，全量换液时更换为成骨分化诱导培养基(培养基使用前需要在37℃水浴锅中预热10min)，然后置于CO2培养箱中常规培养，每3d更换1次成骨分化诱导培养基。

　　1.5主要观察指标

　　1.5.1感染慢病毒后绿色荧光蛋白表达的检测感染慢病毒后第7天，用倒置荧光相差显微镜观察增强绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况。

　　1.5.2Westernblot检测目的蛋白P75NTR过表达水平感染慢病毒后第7天，用Westernblot检测P75NTR蛋白的过表达情况，向6孔板中加入胰蛋白酶消化细胞，离心，移至1.5mLEP管中，加入细胞裂解工作液(裂解液∶蛋白酶抑制剂=100∶1)冰上裂解30min，期间超声碎裂3个循环(每个循环3次，每次超声10s，间隔10s)，裂解后低温高速离心(4℃，12000r/min，20min)，收集上清液，取10µL采用BCA蛋白浓度测定试剂盒按说明书制作蛋白标准曲线测定样品蛋白的浓度，余上清液按体积的1/3加入4×LodingBuffer，100℃水浴10min后存放于-80℃超低温冰箱中，以做后续Westernblot实验。配置10%丙烯酰胺凝胶，上样：加入实验组、阴性对照组及空白组的样品蛋白各10µg(用1×LodingBuffer配平使各孔上样体积一致);电泳：上样完毕后，加入电泳液电泳(电泳参数：恒压80V，30min;120V，1h);转膜：冰浴转膜至PVDF膜上(转膜参数：恒流200mA，90min);封闭：用TBST提前配置5%牛奶封闭液备用，将转好的PVDF膜放入封闭液置于摇床上封闭(48r/min，2h);孵抗：配置一抗工作液(P75NTR或GAPDH∶一抗稀释液=1∶1000)，将封闭好的PVDF膜洗膜后放置于各自相对应的一抗工作液格子中，摇床摇匀后4℃冰箱孵育过夜;配置二抗工作液(P75NTR∶5%牛奶=1∶8000;GAPDH∶5%牛奶=1∶5000)，取出一抗孵育过夜的PVDF膜，洗膜3次后放于二抗工作液格子中置于摇床上室温慢摇孵育2h;发光：配置发光工作液，孵抗完毕的PVDF膜用TBST洗3次后沾干，均匀滴加发光工作液，置于凝胶成像仪中显像。

　　1.5.3碱性磷酸酶活力检测成骨分化情况取成骨分化诱导培养后第7，10，14天的细胞培养板，吸去上清，加入胰蛋白酶室温消化3min，加入完全培养基终止消化，用移液器沿底部吹打下细胞，将含有细胞的液体全部移至离心管中离心(1000r/min，10min)，弃上清，沉淀细胞置于冰上，加入200µLPBS，使用超声破碎5个周期(每个周期3次，每次10s，间隔10s，每个循环间隔1min)，裂解后低温高速离心(4℃，12000r/min，20min)，收集离心后的上清液，取10µL用BCA蛋白浓度测定试剂盒按说明书制作蛋白标准曲线测定样品蛋白的质量浓度(g/L)，剩余上清液用于检测碱性磷酸酶活力。细胞中碱性磷酸酶活力检测：取96孔板，分5组，即空白孔、标准孔、3个样本测定孔(空白对照组、阴性对照组、P75NTR过表达组)，每组5个复孔。空白孔加入30µL双蒸水;标准孔加入30µL酚标准应用液(0.02g/L);样本测定孔加入不同样本各30µL;再向每个孔中加入缓冲液及基质液各50µL，轻摇充分混匀后将96孔板用锡纸封包后置于37℃温箱中温育15min，取出孔板向每个孔中加入显色剂150µL，振摇混匀后用酶标仪测定各孔的吸光度值。细胞中碱性磷酸酶活力=(样本测定孔吸光度值-空白孔吸光度值)/(标准孔吸光度值-空白孔吸光度值)×酚标准应用液浓度/样本的蛋白浓度。

　　1.5.4茜素红染色检测矿化结节形成情况感染后经成骨诱导培养至第7，14天，吸弃培养基，加入PBS轻轻吹洗3次，吸尽PBS后向每孔中加2mL40g/L甲醛固定溶液，室温放置固定30min;去固定液加入PBS冲洗3次;去PBS每孔加入1mL茜素红染液染色5min;吸尽茜素红染液加入PBS冲洗3次;置于倒置显微镜下观察茜素红染色情况。

　　1.6统计学分析结果均用x_±s表示，用SPSSStatistics20.0软件进行统计学分析，均数比较采用两样本t检验，多组之间的差异比较采用多样本均数比较的方差分析。计算P值，P<0.05为差异有显著性意义。

　　2结果Results

　　2.1骨髓间充质干细胞的大体形态全骨髓贴壁分离法培养的骨髓间充质干细胞可以正常生长，细胞呈长梭形，有触角。传代培养后的第2代细胞形态无明显变化，见图1。

　　2.2P75NTR过表达慢病毒滴度包装后收集的P75NTR过表达慢病毒保存液用qPCR定量检测结果为1×109TU/mL。由上海吉凯基因公司提供检测数据。

　　2.3感染慢病毒后绿色荧光蛋白表达慢病毒感染法能将目的质粒转染进骨髓间充质干细胞中，且能高表达绿色荧光蛋白，感染效率约90%，见图2。

　　2.4Westernblot检测P75NTR蛋白表达水平P75NTR过表达组骨髓间充质干细胞的P75NTR蛋白表达量远高于阴性病毒对照组及正常细胞未转染组(P<0.05)，差异有显著性意义，阴性病毒对照组及未转染组间P75NTR蛋白表达量无明显区别(P>0.05)，差异无显著性意义，见图3及图4。

　　2.5碱性磷酸酶活力检测结果P75NTR过表达组细胞的碱性磷酸酶活力在各时间点均较阴性病毒对照组和未转染组降低(P<0.05)，差异有显著性意义，阴性病毒对照组和未转染对照组之间比较无明显差别(P>0.05)，差异无显著性意义。随着诱导时间的延长，各组细胞的碱性磷酸酶活力均逐渐升高(P<0.05)，差异有显著性意义，见表1及图5。

　　2.6矿化结节的茜素红染色结果诱导成骨分化后第7天通过茜素红染色倒置显微镜观察，可见P75NTR过表达组的孔板中无明显的红色结节形成，细胞发生聚集生长分布，而阴性病毒对照组及未转染组均可见数个染成红色的结节，周围大量细胞聚集生长，细胞聚集生长情况较P75NTR过表达组明显，见图6A-C。诱导成骨分化后第14天通过茜素红染色倒置显微镜观察，可见P75NTR过表达组的孔板中只有少量红色深染结节形成，而阴性病毒对照组及未转染组均可见大量的深染结节，部分矿化结节暗色不透光，近似形成的骨组织，见图6D-F。P75NTR过表达组在2个时间点的成骨分化程度均显著弱于阴性病毒对照组及未转染组，成骨时间显著延长，因此P75NTR过表达负向调控了骨髓间充质干细胞的成骨分化。

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