基于自然对流ＰＣＲ与毛细管电泳技术的牙周病原菌检测
发布时间：2020-02-15
摘要：细菌种类的快速识别在牙病防治中具有重要的应用价值。以牙周病原菌为研究对象，建立了DNA快速扩增的自然对流聚合酶链式反应(PCR)方法及毛细管电泳荧光光学检测系统。研究表明，当毛细管有效长度为8cm、电场强度为100V/cm时，50bpDNAladder在筛分介质为0.5%HEC(羟乙基纤维素)(1300K)中的分离效果最佳。毛细管电泳结果表明，采用自然对流法可以在25min内在圆柱腔体中实现牙周病原菌的快速PCR。
关键词：毛细管电泳系统;聚合酶链式反应(PCR);自然对流
引言
牙周病仅次于龋病，是危害人类牙齿健康的第二大口腔疾病，通常是由龈下菌斑引起的[1-3]。人口腔内的细菌附着在牙齿表面形成牙菌斑，当这些细菌及其产物进入牙龈，便会引起牙龈纤维溶解及炎症，炎症导致牙槽骨吸收，随之牙齿出现松动甚至脱落[4]。据世界卫生组织统计，90%～95%的老年人都患有不同程度的牙周病，这也是人牙齿过早脱落的主要原因。同时，研究表明，牙周病还与中风、冠心病、糖尿病等疾病有一定的关系。随着我国进入老龄化社会，这一健康问题将日益突出，为此，及时发现早期牙周病症，并对其加以控制和治疗，对牙齿健康具有重要的意义。
研究表明，在一些破坏性牙周病及其传播中，特异性病原菌的作用成为大家研究的焦点。在这些牙周病致病菌中，革兰氏阴性杆菌如齿垢密螺旋体(treponemadenticola，T.d)等被认为是与牙周病发病机理密切相关的细菌[5]。它们在牙周病患者的口腔中大量生存，而在健康者口腔中没有发现或存在数量极少。为此，微生物检测有助于实现牙周病的早期诊断。虽然目前有细菌培养、形态学观察、荧光抗体法[6]等方法对细菌进行鉴定和检测，但这些方法因费时、费力、缺乏准确性，使牙周病致病菌的检验在临床应用上受到很大限制，难以推广。因此，建立快速的菌种检测方法对研究牙周病致病菌及牙周病预防和治疗有非常重要的意义。
尽管现行的聚合酶链式反应[7-9](polymerasechainreaction，PCR)方法效率相对较高，但是传统的PCR热循环仪受变温效率的限制，DNA样品扩增时间相对较长。为此，本文基于自然对流理论，在试建的便携式自然对流PCR(naturalconvectionPCR，NC-PCR)系统中对齿垢密螺旋体实现了快速PCR，并采用毛细管电泳法[10-11]对其PCR产物实现了快速检测。
1原理及方法
自然对流PCR[12-13]是在一个圆柱型腔体内进行的，腔体的上表面保持低温(55℃)，下表面保持高温(97℃)。由于上下表面温度差使得腔体内不同位置流体的密度分布不同，温度高的流体密度小，温度低的流体密度大，从而使得底部液体上升，腔内顶部液体下降，最终使得液体在腔体内形成对流循环。当腔体内注入含有DNA模板及引物的PCR反应液时，通过优化圆柱腔体的几何尺寸，腔体反应液便可以携带DNA经PCR的不同温区，最终实现DNA的自然对流PCR。
依据电泳的基本原理，实验室自制了毛细管电泳荧光光学检测系统，如图1所示，其核心部件为石英毛细管(PolymicroTechnologies，美国)、正置显微镜BX51(奥林巴斯，日本)、MODEL610E高压电源(Trek公司，美国)。其工作原理如下：汞灯光源发出的光经U-MWIB-3滤光片(奥林巴斯，日本)过滤后产生波长为494nm的激发光;DNA与荧光染料SYBRGreenI结合物在高压电场下流经毛细管，当DNA经过毛细管窗口时，受入射光激发(494nm)，产生中心波长为521nm的荧光;荧光经光电倍增管R928(滨松光子学株式会社，日本)收集，获得DNA的电泳图谱，经CCD收集，可获取DNA在毛细管内的运动图像。为降低电渗流，采用线性聚丙烯酰胺对毛细管内壁进行镀膜处理，电泳过程是在25℃的恒温暗室中完成。
2试剂配制
2.1PCR反应试剂配制
在研制的便携式自然对流PCR系统中对齿垢密螺旋体T.d实施PCR反应。T.d引物为5′-AAGGCGGTAGAGCCGCTCA-3′和5′-AGCCCGCGCTCA-3′(生工生物工程(上海)股份有限公司)，对应的PCR产物片段为283bp(bp表示碱基对)。将3.5μL10×FastBufferI、2.7μLdNTPMixture、0.7μLT.dDNA模板、0.7μL引物、0.175μLSpeedSTARHSDNAPolymerase(宝日医生物技术(北京)有限公司)、26.525μL灭菌水混合于离心管内。
2.2电泳试剂配制
用电子天平称取0.05g的羟乙基纤维素(hydroxyethylcellulose，HEC)(1300K)，取9.95mL0.5×TBE(Tris-borate-EDTA，TBE)缓冲液，将HEC缓缓倒入0.5×TBE缓冲液中，之后将HEC溶液置于磁力搅拌器上搅拌一周。取99μL的HEC溶液和1μL的100×SYBRGreenI配置成筛分溶液，取2μL的50bpDNAladder(北京索莱宝科技有限公司)和98μL的水配置成1.8ng/μL样品溶液。
2.3PCR反应液稀释
从自然对流圆柱腔体中取出35μLPCR溶液，放置于离心管，再往离心管中加入35μL的纯净水，将反应液稀释50%。
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3结果与讨论
3.1筛分介质质量分数对DNA分离效率的影响
筛分介质的质量分数决定了高分子线团在溶液中的分布状态。质量分数较低时，高分子线团之间相互分离，随着筛分介质质量分数的增加，高分子线团之间相互交缠，分离DNA的能力也随之增加。为此，研究了电场强度为100V/cm时，HEC(1300K)筛分介质质量分数对小片段DNA(<500bp)的分离能力。研究显示：当HEC质量分数为0.2%时，尽管可以在6min内分离出DNA，但相邻DNA片段几乎重叠在一起，分离度较低，见图2(c);当HEC质量分数为0.5%时，虽然分离时间有所增加，但是相邻DNA之间分离度明显提高，见图2(b);当HEC质量分数为0.8%时，分离时间与分离度变化较小，见图2(a)。为此，本实验以0.5%HEC为筛分介质分离DNA。
3.2电场强度对DNA分离效率的影响
由于DNA经磷酸基团水解后带负电，当毛细管两侧施加电压时，电场强度决定了DNA在电泳缓冲液中所受电场力的大小。电场力越大，DNA运动速度越快，分析时间越短;反之，电场力越小，DNA运动速度较慢，分析时间延长。为此，研究了其他电泳条件一定时，电场强度对毛细管电泳分离DNA能力的影响。图3显示了DNA样品在80V/cm、100V/cm、120V/cm电场强度下的分离结果：随着电场强度的增加，DNA分析时间由11min降低至7.5min以内;当电场强度由100V/cm升高至120V/cm时，250bp与300bpDNAladder之间分离度明显降低，整个DNA样品分析时间无明显缩短。为此，采用100V/cm电场强度分离DNA样品。
3.3毛细管有效长度对DNA分离效率的影响
毛细管有效长度决定了DNA片段在毛细管中的实际迁移距离。毛细管有效长度越小，DNA在筛分介质中迁移距离越短，DNA分析时间越短。然而，若毛细管有效长度过小，DNA尚未分离便已运动至检测窗口，会造成相邻DNA片段间分离度过低。为此，研究了其他电泳条件一定时，毛细管有效长度对DNA分离结果的影响。图4为毛细管总长度为15cm、电场强度为100V/cm时，50bpDNAladder在不同的毛细管有效长度时的分离结果。数据显示：当毛细管有效长度从7cm增加至9cm时，电泳分离时间由6.7min增加至8min，相邻DNA片段间分离度变化不明显;当有效长度为8cm时，分离效果最佳。
3.4毛细管电泳检测自然对流PCR产物
将底面直径为1.5mm、高为15mm的圆柱腔体作为自然对流PCR反应腔体，圆柱腔体由聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)材料制成。底面与上表面分别施加温度97℃与55℃，PCR反应液在圆柱腔体内反应25min后将牙周病原菌T.dPCR产物取出，稀释至50%后实施电泳，在优化的电泳条件下采用毛细管电泳检测其PCR产物。图5为电场强度100V/cm，毛细管有效长度为8cm，50bpDNAladder与T.dPCR产物在0.5%HEC(1300K)中的分离结果。数据显示，目标产物电泳峰位于250bp与300bp电泳峰之间，表明在DNA圆柱腔体中可以成功实现自然对流PCR。
4结语
建立了基于自然对流的PCR方法，搭建了共聚焦荧光毛细管电泳光学检测系统。在该检测系统中以50bpDNAladder为研究对象，研究了筛分介质质量分数、电场强度及有效毛细管长度对DNA分离效率的影响。在圆柱型腔体中对齿垢密螺旋体实施了PCR。毛细管电泳结果表明，采用自然对流方法可以在25min内成功实现PCR，后续工作将会设计高通量自然对流PCR芯片。
