不同产地北沙参多糖的性质和生物活性研究

发布时间：2020-02-14

　　摘要：对10个产地北沙参中多糖的提取率、可溶性总糖含量、黏度、分子量分布、抗氧化及降血糖活性进行了研究。结果表明：产地不同，北沙参多糖的理化性质和生物活性存在差异，但具有相似的紫外、红外光谱学性质及分子量分布。多糖提取率范围在(13.20±0.07)%～(26.75±0.01)%之间，可溶性总糖含量范围为(81.28±0.02)%~(89.10±0.10)%，黏度范围为(6.55±0.05)Pa·s～(9.40±0.10)Pa·s;其中产地为河北安国的北沙参多糖对DPPH和羟基自由基的清除率以及对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，半数清除率浓度(halfmaximalinhibitoryconcentration，IC50)分别为0.237、0.564、10.614mg/mL。

　　关键词：北沙参;多糖;理化性质;抗氧化;α-葡萄糖苷酶抑制剂

　　北沙参为伞形科植物珊瑚菜(GlehnialittoralisFr.schmidtexMiq.)的干燥根，其性甘，味微苦、微寒，是传统的药食同源物品，具有养阴清肺、益胃生津、调解免疫系统等功效[1-2]，主产于山东、河北、内蒙及辽宁等地[3]。据文献调研，北沙参中含有苷类、多糖类、香豆素类等成分，其中多糖所占比例最大，具有免疫调节、抗氧化等多种生物活性[4-6]。

　　目前，对北沙参多糖(Glehnialittoralispolysaccha-ride，GLP)的研究主要集中于同一产地提取方法和含量测定方面[7-8]，对不同产地的理化性质及生物活性的差异性报道较少。本研究以北沙参为原料，采用水提醇沉法对10个产地的北沙参多糖成分进行提取，并对各多糖的理化性质和生物活性进行研究，旨在探清北沙参的产地差异性，并为其质量评价提供理论依据。

　　1材料与仪器

　　1.1材料与试剂

　　1，1-二苯基-2-苦味基肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、α-葡萄糖苷酶、对硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-Nitrophenyl-α-D-galactopyra-noside，PNPG)、蓝葡聚糖、标准葡聚糖T5000、T50000、T150000、T270000：上海阿拉丁生化科技股份有限公司生产;无水乙醇、FeSO4、水杨酸、过氧化氢、混和磷酸盐、无水碳酸钠均为分析纯。

　　1.2仪器与设备

　　HH-2恒温水浴锅：江苏金坛宏华仪器厂;N-1100旋转蒸发仪：东京理化株式会社;KS-300DE超声波清洗器：昆山洁力美超声仪器有限公司;UV-2550紫外-可见分光光度计：岛津仪器制造有限公司;TGL-15B高速离心机：上海安亭科学仪器厂;NDJ-4旋转黏度计：上海标卓科学仪器有限公司;S-100傅里叶变换红外光谱仪：珀金埃尔默仪器有限公司;凝胶色谱柱、BSZ-100自动部分收集器、BT-100B数显恒流泵：上海沪西分析仪器厂有限公司。

　　2试验方法

　　2.1北沙参多糖的提取

　　分别取10个产地的北沙参，粉碎，过40目筛，用3倍体积的95%乙醇回流提取2次，残渣干燥备用。取200g北沙参残渣，加入30倍体积的蒸馏水，恒温水浴锅回流2h，离心(8000r/min、4min)，收集上清液，过滤，减压浓缩至小体积，用4倍体积的无水乙醇醇沉，静置过夜，抽滤，干燥[9]，分别命名为GLP-1、GLP-2、GLP-3、GLP-4、GLP-5、GLP-6、GLP-7、GLP-8、GLP-9、GLP-10。

　　北沙参多糖提取率的测定：将制备的10组北沙参多糖精密称重，计算其提取率，多糖提取率/%=多糖重量/北沙参干粉重量×100。

　　2.2北沙参多糖的理化性质

　　2.2.1可溶性总糖含量的测定

　　采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖作为标准品绘制标准曲线，根据标准曲线计算10种北沙参多糖的可溶性总糖含量[10]。

　　2.2.2黏度的测定

　　分别称取1200mg10组北沙参多糖样品，在室温25℃条件下，不经超声波和任何辅助条件下溶于300mL蒸馏水中，配置成浓度为4.0mg/mL的多糖溶液，用黏度计测定其黏度。

　　2.2.3紫外-可见光谱分析

　　分别配制0.1mg/mL的10组北沙参多糖溶液，用紫外-可见分光光度计在200nm～800nm范围内扫描[11]。

　　2.2.4红外光谱分析

　　分别称取1.0mg的10组北沙参多糖样品，与KBr粉末混匀后压片，傅里叶变换红外光谱仪在4000cm-1～5000cm-1波数范围内扫描[12]。

　　2.2.5凝胶渗透色谱法测定分子量分布

　　2.2.5.1标准曲线的绘制

　　分别称取5.0mg标准葡聚糖T5000、T50000、T150000、T270000，溶解于5.0mL的去离子水中，分别上凝胶渗透色谱柱，以蒸馏水为洗脱液，调节凝胶渗透色谱柱流速，设置自动部分收集器收集每管3.0mL，用苯酚-硫酸法测定样品出峰液分布。计算各标准葡聚糖出峰的洗脱体积Ve，利用已知分子量为200万的蓝葡聚糖确定凝胶柱的空体积Vo，利用无水葡萄糖确定凝胶色谱柱的总体积Vt。以有效分配系数纵坐标，以lgMw(Mw为分子质量，molecularweigh)为横坐标作标准曲线。有效分配系数由以下公式求得：有效分配系数=(VeVo)(/Vt-Vo)。

　　2.2.5.2测定多糖分子量及其分布

　　分别准确称取10组北沙参多糖样品5.0mg，加入5.0mL去离子水溶解。将溶解后的多糖溶液放入离心机离心处理，取离心后所得的上清液，过0.45μm滤膜后上样，以去离子水作为洗脱液，调节凝胶渗透色谱柱的流速，设置自动部分收集器使其每管收集3.0mL，之后将收集到的每管样品溶液经苯酚-硫酸法显色，测定其吸光度，从而检测出各多糖样品的出峰液体积分布。根据所得的多糖样品的出峰液体积数据，代入所求得的标准曲线方程，从而计算出各组多糖样品的分子量及其分布[12]。

　　2.3北沙参多糖的生物活性

　　2.3.1抗氧化活性

　　10组北沙参多糖样品清除DPPH自由基、羟基自由基的测定参照文献方法进行[13-14]。2.3.2对α-葡萄糖苷酶抑制活性

　　10组北沙参多糖样品对α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定参照文献方法进行[15]。

　　3结果与讨论

　　3.1北沙参多糖的提取率、可溶性总糖含量和黏度葡萄糖标准曲线见图1。

　　由图1可知，标准曲线的方程为y=12.967x+0.0858，R2=0.9937。根据公式计算10组北沙参多糖样品的可溶性总糖含量。10组北沙参多糖样品的提取率、可溶性总糖含量和黏度见表2。

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　　由表2可知，10个不同产地的北沙参多糖提取率在(13.20±0.07)%～(26.75±0.01)%，内蒙锡林郭勒盟产北沙参GLP-8的提取率最高，为(26.75±0.01)%，安徽亳州产北沙参GLP-1的提取率最低，为(13.20±0.07)%。10种北沙参多糖的可溶性糖含量均在80%以上，内蒙赤峰产北沙参GLP-10的可溶性总糖最高，为(89.10±0.10)%，河北保定产北沙参GLP-7的可溶性总糖含量最低，为(81.28±0.02)%。室温25℃，浓度为4mg/mL的各多糖样品溶液，内蒙赤峰产北沙参多糖GLP-10黏度最大，为(9.40±0.10)Pa·s，河北承德产北沙参GLP-2黏度最小，为(6.55±0.05)Pa·s。对可溶性总糖含量和黏度进行相关性分析，见表3。

　　由表3可知相关性为0.853，属于极强相关，P为0.002，具有强显著性。说明多糖溶液的黏度和可溶性总糖含量成正相关。

　　3.2北沙参多糖的理化性质

　　3.2.1紫外-可见光谱分析

　　10组北沙参多糖的紫外-可见光谱图见图2。

　　由图2可知，在检测范围内，10组北沙参多糖样品均在260nm~280nm范围内无明显吸收，说明各产地的北沙参多糖中均不含蛋白质和核酸[16]，在整个研究体系中，可排除蛋白质和核酸的影响。

　　3.2.2红外光谱分析

　　10组北沙参多糖的红外光谱图见图3。

　　由图3可以看出10组北沙参多糖的峰值，由左向右分别为：3400cm-1为-OH伸缩振动吸收峰，2927cm-1处为C-H伸缩振动吸收峰，1640cm-1处为-OH吸收峰，1421cm-1处为=CH2变形吸收峰，1161cm-1处为C-O吸收峰，1082cm-1处为醇羟基-OH振动吸收峰，847cm-1处为α-型糖苷键[17]。10组不同产地的北沙参多糖的吸收峰峰形与位置相似，均具有多糖的特征吸收峰。

　　3.2.3分子量分布和大小

　　标准葡聚糖T5000、T50000、T150000、T270000经凝胶渗透色谱柱后测得数据，以有效分配系数为纵坐标，以lgMw为横坐标作标准曲线。计算得标准曲线方程为y=-0.4094x+2.3212，其R2=0.99877，表明构建的标准曲线模型较为精确，回归效果和回归拟合效果显著。

　　将试验所得10组北沙参多糖样品洗脱体积代入求得的标准曲线方程，可求出10组多糖样品中的多糖分子量分布及其大小，如图4所示。

　　由图4可知多糖经凝胶渗透色谱柱后，有4个特征吸收峰，即10组北沙参多糖样品均由4个不同分子量大小的多糖组分组成，但分子量之间有差别。

　　3.3北沙参多糖的生物活性

　　3.3.1清除DPPH自由基

　　10组北沙参多糖对DPPH自由基清除作用见图5。

　　由图5可知，10组北沙参多糖样品对DPPH自由基均有一定的清除作用，且呈浓度依赖性。通过比较IC50值，对照品VC和各北沙参多糖对DPPH自由基的清除作用大小：V(C0.005mg/mL)>GLP-3(0.237mg/mL)>GLP-2(1.324mg/mL)>GLP-9(1.749mg/mL)>GLP-4(1.854mg/mL)>GLP-5(1.868mg/mL)>GLP-7(3.015mg/mL)>GLP-6(3.439mg/mL)>GLP-10(4.350mg/mL)>GLP-1(5.161mg/mL)>GLP-8(5.220mg/mL)。由此可知，河北安国产GLP-3对DPPH自由基的清除作用最强。

　　3.3.2清除羟基自由基

　　10组北沙参多糖对羟基自由基清除作用见图6。由图6可知，10组北沙参多糖样品均对羟基自由基均有一定的清除作用，且呈现浓度依赖性。对照品VC和各北沙参多糖对羟基自由基的清除作用大小(IC50值)依次为：VC(0.072mg/mL)>GLP-3(0.564mg/mL)>GLP-6(1.057mg/mL)>GLP-4(1.858mg/mL)>GLP-5(2.221mg/mL)>GLP-1(3.323mg/mL)>GLP-8(3.975mg/mL)>GLP-10(7.090mg/mL)>GLP-9(7.953mg/mL)>GLP-7(9.542mg/mL)>GLP-2(14.819mg/mL)。由此可知，河北安国产GLP-3的清除羟基自由基作用最强。

　　3.3.3对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

　　10组北沙参多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用见图7。

　　由图7可知，10组北沙参多糖样品均对α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，随着多糖浓度的升高，对α-葡萄糖苷酶的抑制能力也不断增强，当达到一定浓度时，抑制能力趋于稳定。对比IC50值，对照品阿卡波糖和各北沙参多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制能力大小为：阿卡波糖(0.501mg/mL)>GLP-3(10.614mg/mL)>GLP-8(10.769mg/mL)>GLP-5(11.485mg/mL)>GLP-4(14.882mg/mL)>GLP-6(18.092mg/mL)>GLP-2(20.850mg/mL)>GLP-7(20.993mg/mL)>GLP-10(22.873mg/mL)>GLP-1(25.331mg/mL)>GLP-9(264.266mg/mL)。由此可知，河北安国产GLP-3对α-葡萄糖苷酶抑制能力最强。

　　4结论

　　本文通过对10个产地的北沙参的多糖进行提取，对其提取率、理化性质及生物活性进行测定，结果表明，不同产地北沙参多糖的提取率存在差异，内蒙锡林郭勒盟产北沙参多糖GLP-8的提取率最高，为(26.75±0.01)%;可溶性总糖含量范围为(81.28±0.02)%~(89.10±0.10)%，其中产地为内蒙赤峰的北沙参多糖(GLP-10)最高;不同产地北沙参多糖具有相似的紫外、红外光谱学性质及分子量分布;产地为河北安国的北沙参多糖(GLP-3)对DPPH和羟基自由基的清除率以及对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，IC50值分别为0.237、0.564、10.614mg/mL。不同产地北沙参多糖理化性质及生物活性存在差异，分析原因可能与不同产地北沙参的栽培管理、采收季节、加工方式的不同有关。近年来，由于市场经济刺激，多数种植户以及加工企业有抢收，或者以次充好的情况存在。在推广规范化生产技术的同时，也不能忽视生长环境对北沙参多糖的影响。