恩施道地药材厚朴有效成分含量差异研究
发布时间：2020-02-13
摘要：以生长周期5年为界限，研究恩施道地药材厚朴中有效成分含量的差异，为厚朴的人工培育类型选择提供参考依据。采取AgilentIntermaxC-18(250mm*4.6mm，5μm)流动相(甲醇∶水=78∶22)，检测波长为294nm，体积流量1mL/min，柱温30℃，进样体积10μL，进行HPLC检测，测定尖叶厚朴、中间型厚朴和凹叶厚朴中厚朴酚及和厚朴酚的含量。结果显示测定的绝大多数植株均含有较高的厚朴酚及和厚朴酚，其中，尖叶厚朴中和厚朴酚及厚朴酚总含量较高，最高可达5.21%，中间型厚朴中和厚朴酚及厚朴酚总含量其次，最高含量为3.47%，凹叶厚朴中和厚朴酚及厚朴酚总含量较低，总含量值为3.14%。因此，建议优先考虑尖叶厚朴作为移植培育的品种，减少凹叶厚朴的种植。
关键词：厚朴;厚朴酚;和厚朴酚;HPLC
1引言
厚朴为木兰科植物厚朴(MagnoliaofficinalisRehd.etWils)或凹叶厚朴(MagnoliaofficinalisRehd.etWils.var.bilobaHehd.etWils)干燥的干皮、根皮及枝皮[1]。厚朴是我国传统的中药，《神农本草经》中把厚朴作为上等药材，《金匮要略》中210个古方中约有25个含厚朴[2-3]，国家中药管理局颁发的首批《古代经典名方目录》中100个方剂中含有厚朴的达12个[4]，由此可知厚朴在中药中的重要作用。传统中医认为厚朴味苦、辛，微温，主要治疗痰饮咳嗽、食积气滞、脘痞吐泻等。现代药理学研究表明，厚朴具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗凝血、抗溃疡、抗组胺、降胆固醇以及保护心脑血管和影响中枢神经系统等多重作用[5-16]。尖叶厚朴主要分布于川贵北部、湖北西部、安徽南部、广西北部以及甘肃东南部;凹叶厚朴主要分布于江浙一带、江西、西北以及云南等地区均有种植[17]。恩施是湖北厚朴主要产地之一，恩施厚朴品质优良，皮厚、质细、油性重、香气浓郁、断面层为棕色、内表皮为深紫色，称之为紫油厚朴，该品种已通过国家原产地域保护[18]。厚朴的主要药效成分为厚朴酚以及和厚朴酚，厚朴药材每年的需求量高达3000t[19]。从2008年至今，国务院或CFDA已颁布十余部法规条例用以保护规范中药材。目前，多种原因造成厚朴品种混乱，资源缺乏，道地产量日趋骤减，质量参差不齐。我们以湖北恩施道地产区厚朴为研究对象，采集5年生厚朴干皮，以厚朴酚及和厚朴酚含量为指标，评价不同品种的厚朴质量，为厚朴人工栽培品种的选择提供参考依据。
2材料与方法
2.1实验材料
厚朴(采自湖北省恩施州鹤峰县，经武汉轻工大学曾万勇副教授鉴定)、和厚朴酚标准品(中国食品药品检定研究院编号110730)、厚朴酚标准品(中国食品药品检定研究院编号110729)。
2.2实验仪器与试剂
色谱甲醇(德国默克股份有限公司)，分析纯甲醇(上海沃凯生物技术有限公司)，纯净水;AL204-分析天平(美国MettlerToledo公司)，SB25-12DT超声波清洗机(宁波新芝生物科技有限公司)，Agilent-1260Ⅱ高效液相色谱仪(安捷伦公司)，色谱柱：AgilentIntermaxC-18(250mm*4.6mm*5μm)(美国Agilent公司)，粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)。
2.3实验方法
2.3.1厚朴样品的采集与类型划分
厚朴采集时间为2018年5月15日，地点为恩施鹤峰县下六峰村，树龄均为5年生厚朴，采样部位均距地面20-40cm处树干，经曾万勇副教授鉴定叶先端有圆钝小凹尖为木兰科厚朴MagnoliaofficinalisRehd.etWils，叶先端凹缺成二裂为凹叶厚朴Magno-liaofficinalisRehd.etWils.var.bilobaHehd.etWils，其余为中间类型[20-21]。样品阴干，备用。
2.3.2水分含量测定取
2.3.1中样品以甲苯法[1]测定水分含量。
2.3.3方法学
(1)色谱条件：流动相比例(甲醇∶水=78∶22)，柱温30℃，检测波长为294nm，流速1mL/min，进样量10μL。
(2)标准品含量测定：取厚朴酚标准品适量，用色谱甲醇溶解，使其浓度为40μg/mL，备用;取和厚朴酚标准品适量，用甲醇溶解，使其浓度为25.6μg/mL，备用。取上述溶液按2.3.1中条件HPLC进样检测。
(3)样品含量测定：取2.1中处理好的厚朴，用粉碎机粉碎，过三号筛，精密称定0.2g，放在具塞锥形瓶中，加入25mL甲醇，均匀混合，室温超声20min，浓缩过滤，取滤液5mL，用甲醇定容至25mL容量瓶，即得。取上述溶液按2.3.1中条件HPLC进样检测。
(4)精密度实验：取厚朴标准品溶液，按2.3.1中条件，重复进样6次，用高效液相色谱仪进行检测，记录色谱图，测定其峰面积，并计算RSD值。
(5)稳定性实验：取厚朴标准品1份，室温储存，于0h，2h，4h，6h，8h，12h，24h进样检测，测定厚朴酚及和厚朴酚的峰面积并计算出其RSD值。
(6)重复性实验：取厚朴样品6份，按2.3.3(3)的处理方法进行处理，再按2.3.1中条件进样，检测厚朴酚以及和厚朴酚的峰面积并计算出其RSD值。
(7)加样回收率实验：取厚朴样品，精密称定厚朴6份，分别加入适量的厚朴酚及和厚朴酚对照品，放在具塞锥形瓶中，加入25mL甲醇，均匀混合，室温超声20min，浓缩过滤，取滤液5mL，用甲醇定容至25mL容量瓶，即得。取上述溶液按2.3.1中条件HPLC进样检测。测定含量，并计算加样回收率和RSD。
2.4数据处理及其分析
实验数据处理及其作图采用GraphpadPrism5进行，采用SPSS22.0统计分析软件进行数据分析及相关性检验。
3结果与分析
3.1含量
3.1.1水分含量
由甲苯法测定水分结果可知，阴干处理的30株厚朴样品平均含水量为10.30%，满足《中国药典》2015规定，水分含量不得超过15.0%。表明本次采集的厚朴样品水分含量符合相关规定。
3.1.2样品含量
利用外标一点法进行计算厚朴酚及和厚朴酚的含量，结果如下表1所示。
各类型中的厚朴酚平均含量、和厚朴酚的平均含量、厚朴酚与和厚朴酚的比值倍数关系如图1所示。
3.2方法学
3.2.1精密度试验
其测定结果为：连续6次进样的厚朴酚标准品的峰面积RSD为0.28%，连续进样6次的和厚朴酚标准品的峰面积RSD为0.13%，表明本次实验的精密度良好。
3.2.2稳定性的测定
其检测的厚朴酚的峰面积RSD为0.21%，和厚朴酚的峰面积RSD为0.31%，表明该方法检测效果良好。
3.2.3重复性试验
6次供试品和厚朴酚的峰面积RSD为1.18%，厚朴酚重复检测的峰面积RSD为1.05%，表明该方法准确可靠。
3.2.4加样回收率的试验
加样回收率如表2和表3所示，表明该法具有良好的回收率。
4分析与讨论
4.1厚朴酚的含量讨论
通过图1A可以发现，尖叶厚朴的厚朴酚含量较高，平均含量为2.41%，中间型厚朴含量其次，平均含量为2.00%，凹叶厚朴的厚朴酚含量较低，平均含量为1.72%，尖叶厚朴与中间型厚朴无明显差异性，中间型厚朴与凹叶厚朴也无明显的差异性，但尖叶厚朴与凹叶厚朴则具有较明显的差异性。
4.2和厚朴酚的含量讨论
通过图1B可以发现，尖叶厚朴的厚朴酚含量较高，平均含量为1.45%，中间型厚朴含量其次，平均含量为0.71%，凹叶厚朴的厚朴酚含量较低，平均含量为0.43%，尖叶厚朴与中间型厚朴有非常明显的差异性，中间型厚朴与凹叶厚朴有差异性，但尖叶厚朴与凹叶厚朴则无明显的差异性。
4.3厚朴酚比和厚朴酚含量倍数关系讨论
通过图1C可以发现，尖叶厚朴中厚朴酚与和厚朴酚的相对含量差异较小，仅为1.66倍，中间型厚朴中厚朴酚与和厚朴酚的相对含量差异较大，厚朴酚的平均含量是和厚朴酚含量的2.82倍，凹叶厚朴中两者差异较大，厚朴酚平均含量是和厚朴酚平均含量的4.00倍，尖叶厚朴与中间型厚朴有较明显的差异性，中间型厚朴与凹叶厚朴无明显的差异性，但尖叶厚朴与凹叶厚朴则具有较明显的差异性。
4.4各类型厚朴中厚朴酚及和厚朴酚总含量关系讨论
通过图1D可以发现，尖叶厚朴中厚朴酚及和厚朴酚总含量最高，最高总含量为5.21%，中间型厚朴总含量其次，最高总含量值为3.47%，凹叶厚朴中厚朴酚及和厚朴酚的总含量相对较低，最高总含量为3.14%。尖叶厚朴与中间型厚朴具有较明显性差异，中间型厚朴与凹叶厚朴有明显性差异，尖叶厚朴与凹叶厚朴具有很明显性的差异。
总体来看，三种类型厚朴中厚朴酚的含量均高于和厚朴酚含量。尖叶厚朴较中间型厚朴和凹叶厚朴品质均好，凹叶厚朴中厚朴酚、和厚朴酚含量最低，因此，在对厚朴栽种过程中，建议少栽种凹叶厚朴品种，优先考虑尖叶厚朴栽培。
恩施道地药材厚朴有效成分含量差异研究相关期刊推荐：《中国医院药学杂志》(半月刊)创刊于1981年，是中国科协主管、中国药学会主办的公开发行的医院药学专业性学术期刊。主要面向全国医院药学工作者、医务人员和广大药学工作者，主要介绍国内外药学先进技术、临床合理用药、中西药制剂、药剂科的科学管理与改革、药学基础知识及理论等。
