白藜芦醇抗疲劳作用及其机理研究
发布时间：2020-02-12
摘要：为了探讨白藜芦醇抗疲劳作用效果及其可能的作用机理，采用力竭训练动物模型，将大鼠分为空白对照组、低剂量白藜芦醇组、中剂量白藜芦醇组、高剂量白藜芦醇组，各组连续灌胃蒸馏水或不同剂量白藜芦醇。灌胃4周后进行力竭跑步实验，测定力竭时间以及血乳酸(bloodlacticacid，BLA)、血尿素氮(bloodureanitrogen，BUN)、肝糖原、肌糖原、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)，谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase，GPx)，过氧化氢酶(catalase，CAT)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)等疲劳相关生化指标。结果发现，白藜芦醇具有抗疲劳作用，其能延长大鼠力竭跑步时间;降低BLA、BUN、肝组织中MDA含量;增加肝、肌糖原以及肝组织中SOD、GPx、CAT含量。白藜芦醇抗疲劳机理可能是：1)白藜芦醇能降低代谢产物的堆积或快速清除代谢产物;2)白藜芦醇能改善运动代谢控制和能量代谢活化;3)白藜芦醇能提高体内抗氧化酶活性，与内源性抗氧化剂形成协同抗氧化网络来降低氧化应激;4)白藜芦醇能减少自由基引起的脂质过氧化，保护肝细胞膜完整性。白藜芦醇有可能成为一种新的功能性食品或营养补剂应用在运动营养领域。
关键词：白藜芦醇;抗疲劳;大鼠;力竭跑步训练;机理
疲劳是涉及许多生理和生化作用的一种机体复杂综合症状，也是脑力或体力活动达到一定强度时必须发生的机体生理保护现象[1]。疲劳不仅使机体工作能力暂时下降，而且还是机体处于亚健康状态或发展成疾病状态的前兆，表明机体的健康即将或已经受到损害。根据症状表现不同，疲劳可分为体力和脑力疲劳。体力疲劳(也称外周疲劳)主要表现为运动能力下降，机体不能维持预定的运动强度。脑力疲劳主要表现为意志和行为的负面变化，如精神失常、健忘、失眠、抑郁、头晕等。体力疲劳是影响机体健康的重要因素之一，长期持续体力疲劳可能会导致机体过早衰老、患肿瘤、心脑血管等疾病风险增高[2]。在过去的几十年里，研究人员对体力疲劳的机理进行了众多研究，并提出了各种理论，如阻塞理论、能源物质耗竭理论、内环境稳定性失调理论、保护抑制理论、突变理论、自由基理论等[3]，其中，自由基理论最受关注。自由基能引起线粒体呼吸链产生三磷酸腺苷(adenosinetriphos-phate，ATP)过程受损，使细胞能量合成发生障碍，影响肌纤维收缩功能;另外，运动时机体代谢增强，耗氧量增加，导致机体各组织中产生过多的自由基与活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)，这可能超过机体自身抗氧化防御系统(酶与非酶)的清除能力，产生氧化应激。过量的自由基与ROS可以攻击脂质、蛋白质、DNA等细胞大分子，从而使正常的细胞功能恶化，出现组织损伤、肌肉收缩能力下降等现象而产生疲劳[4]。近年来的研究已证实，外源性抗氧化剂可通过抑制或阻止细胞内可氧化底物的氧化、抑制脂质过氧化反应、直接清除自由基或与内源性抗氧化剂形成协同抗氧化网络来降低氧化应激，延迟体力疲劳[5]。因此，对机体补充外源性抗氧化剂是延缓体力疲劳的一种行之有效的方法。近些年，一些多糖、皂苷、黄酮类化合物、小分子肽类等天然抗氧化活性成分已被发现具有显著的抗疲劳作用[3，6-7]。
白藜芦醇(3，4'，5-三羟基芪，resveratrol)为二苯乙烯类的多酚类化合物，是植物面对病原体感染和各种自然恶劣条件下而产生的一种天然植物化学物质。目前白藜芦醇已在葡萄、花生、部分浆果及草药等70多种植物中被发现，其中葡萄皮中含量最高，可达50mg/kg～100mg/kg[8]。现代药理学研究证实，白藜芦醇具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗衰老、抗病毒、保护肝与肾及免疫调节作用[9]。此外，白藜芦醇在体内、体外均表现出强烈的抗氧化活性，能有效的清除各类自由基，抑制脂质过氧化反应[10-11]。鉴于白藜芦醇的强抗氧化性，可以推测白藜芦醇有可能与机体内源性抗氧化酶协同作用，清除剧烈运动产生的过量自由基、降低氧化应激而发挥抗疲劳作用。因此，本研究采用力竭训练动物模型，在预实验基础上，分别灌胃不同剂量白藜芦醇，测定其抗疲劳效果，并从不同角度入手，探寻其抗疲劳可能的机制，这将为白藜芦醇在运动营养领域的应用及开发提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料与试剂
1.1.1化学品与试剂
白藜芦醇(纯度99%)：北京莱耀生物科技有限公司;血乳酸(bloodlacticacid，BLA)测定试剂盒：北京雷根生物技术有限公司;血尿素氮(bloodureanitrogen，BUN)测定试剂盒：中生北控生物科技有限公司;肝、肌糖原测定试剂盒：北京索莱宝科技有限公司;超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase，GPx)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)测定试剂盒：南京建城生物技术研究所;试验中所使用的其他化学品均为分析纯，试剂的配制采用双蒸水。
1.1.2主要仪器
ZH-PT型动物实验跑台：安徽正华生物仪器设备公司;UV5型分光光度计：瑞士梅特勒-托利多公司;HH-501型水浴锅：江苏省金坛市友联仪器研究所;5424R台式离心机：德国Eppendorf公司;ELx808型酶标仪：美国Biotek公司;QL-901型旋涡混合器：海门市麒麟医用仪器厂。
1.1.3实验动物
健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(体重180g~200g)：河南省实验动物中心提供。动物分笼饲养于标准化饲养室，保持12h的昼夜循环，室内温度控制在(22±2)℃，湿度控制在(50±5)%;动物自由摄取标准饲料与水。
1.2方法
1.2.1动物分组与治疗
经过7d适应环境后，将大鼠按体重随机分为4组，每组8只，分别是低剂量白藜芦醇组(low-doseresveratroltreatmentgroup，L-ReG)、中剂量白藜芦醇组(medium-doseresveratroltreatmentgroup，M-ReG)、高剂量白藜芦醇组(highdoseresveratroltreatmentgroup，H-ReG)、空白对照组(controlgroup，CG)。3个白藜芦醇组分别接受25、50、100mg/kg·bw剂量的白藜芦醇灌胃治疗(剂量选择来自于预实验，白藜芦醇溶于1.0mL蒸馏水中制成悬浮液)，空白对照组接受等剂量蒸馏水，每天一次，连续4周。所有的动物实验操作均严格依照《国务院实验动物管理条例》以及《河南省实验动物管理办法》中的相关规定进行，并被河南工业大学实验动物伦理委员会批准。
1.2.2大鼠跑步运动
大鼠跑步运动包括适应性训练、强化训练及力竭实验。第1周进行适应性训练，药物灌胃30min后，将大鼠放在实验跑台上(跑道规格为1000mm×90mm×120mm)进行跑步20min训练(坡度倾角设置为0°，速度15m/min);第2~4周进行强化训练，药物灌胃30min后，将大鼠放在实验跑台上进行跑步20min训练(坡度倾角设置为0°，速度30m/min);第4周最后一天(第28天)，药物灌胃30min后，将大鼠放在实验跑台上进行力竭跑步实验，坡度倾角设置为10°，以速度30m/min跑步至力竭。力竭被定义为大鼠不能继续跑动，呼吸急促、俯卧垂头、滞留跑道后端，经电刺激后仍无效，且抓起大鼠时无挣扎动作[12]。记录力竭跑步时间。
1.2.3疲劳相关生化指标测定
力竭跑步结束后，将大鼠在乙醚麻醉后剖开腹腔，腹主动脉取血，储存在-80℃用于分析BLA与BUN;然后快速切除肝脏与股四头肌，用预冷生理盐水漂洗后滤纸吸干，然后储存在-80℃用于测定肝、肌糖原含量以及肝组织中SOD、GPx、CAT、MDA的含量。所有生化指标测定均按照试剂盒说明书进行。
1.2.4统计学分析
测定结果用mean±SD表示，数据处理采用SPSS软件进行过单因素方差(ANOVA)分析，组间比较用PostHoc检验，p<0.05被认为具有统计学意义。
2结果与分析
2.1白藜芦醇对大鼠力竭跑步时间的影响
在运动过程中，耐力增强代表着疲劳感降低，因此判定药物抗疲劳作用最直接指标是运动耐力的强弱[13]。动物力竭跑步运动一种实验性运动模型，很适合评价机体运动耐力，并具有良好的重现性，力竭时间的长短能够客观反映药物抗疲劳能力[14]。白藜芦醇对大鼠力竭跑步时间的影响见图1。
由图1可以看出，与空白对照组(CG)组相比，3个不同剂量白藜芦醇组(L-ReG、M-ReG、H-ReG)力竭跑步时间均显著增加(p<0.05)，增加率分别为13.59%、25.60%、34.73%。这表明，白藜芦醇能延长大鼠力竭跑步时间，增强运动耐力，具有抗疲劳作用。
2.2白藜芦醇对运动后大鼠血乳酸的影响
糖酵解是剧烈运动的主要能量来源。当肌肉从无氧酵解中获得足够能量时，会产生相当数量乳酸(碳水化合物的糖酵解产物);乳酸浓度的增加会降低肌肉和血液中pH值，从而引起各种生理和生化副作用而产生疲劳。减少乳酸的堆积或快速清除乳酸有利于缓解体力疲劳[15]。因此，BLA是体力疲劳的敏感指标之一。白藜芦醇对运动后大鼠血乳酸的影响见图2。
由图2可以看出，与空白对照组(CG)组相比，3个不同剂量白藜芦醇组(L-ReG、M-ReG、H-ReG)BLA含量显著降低(p<0.05)，降低率分别为15.82%、19.42%、34.58%。这说明，白藜芦醇能减少运动后乳酸的堆积或快速清除乳酸，从而缓解疲劳。
2.3白藜芦醇对运动后大鼠血尿素氮的影响
尿素氮是蛋白质和氨基酸的代谢产物。尿素在肝脏中形成，是蛋白质代谢的终产物，由血液携带到肾脏排泄[16]。当碳水化合物和脂肪分解代谢所产能量无法满足机体需要时，蛋白质和氨基酸就开始分解代谢以满足能量需求。BUN含量增加会反映出蛋白质和氨基酸的分解加剧，这会破坏肌肉收缩力并最终导致体力疲劳。BUN和运动耐力之间存在负相关，即机体能够适应运动耐力程度越低，BUN增加就越显着[17]。因此，BUN是体力疲劳的另一敏感指标。白藜芦醇对运动后大鼠血尿素氮的影响见图3。
由图3可以看出，与空白对照组(CG)组相比，中、高剂量白藜芦醇组(M-ReG、H-ReG)BUN含量显著降低(p<0.05)，降低率分别为14.98%、24.14%;低剂量白藜芦醇组(L-ReG)BUN含量虽然也轻微降低，但没有统计学意义(p>0.05)。这说明，白藜芦醇能减少BUN的积累，降低蛋白质代谢而缓解疲劳。
2.4白藜芦醇对运动后大鼠肝、肌糖原的影响
运动耐力强弱与能量储存及供应密切相关。糖原作为能量的重要来源，用于补充运动期间的血糖消耗，并维持血糖稳定在生理范围内。剧烈运动时，首先肌糖原被耗尽，接着肝糖原氧化分解产生葡萄糖来提供血糖;当肝糖原被耗尽时会发生体力疲劳[18]。增加糖原的储存或减少糖原的消耗可提高运动耐力，延迟疲劳的发生。白藜芦醇对运动后大鼠肝、肌糖原的影响见图4。
由图4可以看出，与空白对照组(CG)组相比，3个不同剂量白藜芦醇组(L-ReG、M-ReG、H-ReG)肝、肌糖原含量显著增加(p<0.05)，肝糖原增加率分别为28.27%、57.24%、69.16%;肌糖原增加率分别为27.58%、37.07%、47.41%。这说明，白藜芦醇能改善运动代谢控制和能量代谢活化，通过增加肝、肌肉糖原的储存来改善体力疲劳。
2.5白藜芦醇对运动后大鼠肝组织抗氧化酶的影响
剧烈运动造成耗氧量增加，产生大量活性氧(ROS)与自由基，导致体内内源性抗氧化防御系统动态平衡发生紊乱产生氧化应激。过量的ROS与自由基能攻击细胞膜、蛋白质、脂质、DNA等，造成氧化损伤。此外，ROS不仅能直接影响能量供应和兴奋-收缩偶联过程中的酶活性，而且还加速BLA和SUN的积累[19]。正常情况下，机体有酶和非酶抗氧化剂这两种主要的内源性防御系统，能减少ROS与自由基的有害作用，降低氧化应激。SOD、GPx、CAT是机体内重要的抗氧化酶。SOD是超氧自由基清除因子，能将O2-·转化为H2O2;GPx将H2O2或氢过氧化物还原成H2O和醇;CAT能催化H2O2分解成H2O和O2[20]。但这些抗氧化酶在疲劳和其他疾病状况下会发生减弱现象。白藜芦醇对运动后大鼠肝组织抗氧化酶的影响见图5。
由图5可以看出，与空白对照组(CG)组相比，3个不同剂量白藜芦醇组(L-ReG、M-ReG、H-ReG)SOD与GPx含量显著增加(p<0.05)，SOD增加率分别为22.19%、33.71%、36.55%;GPx增加率分别为12.98%、16.39%、25.60%。中、高剂量白藜芦醇组(M-ReG、HReG)CAT含量显著增加(p<0.05)，增加率分别为15.19%、22.88%;低剂量白藜芦醇组(L-ReG)CAT含量虽然也轻微增加，但没有统计学意义(p>0.05)。这说明，白藜芦醇不仅能作为外源性抗氧化剂直接延缓疲劳，而且还能提高机体内抗氧化酶活性，与内源性抗氧化防御系统形成协同抗氧化网络来对抗氧化应激，发挥抗疲劳作用。
2.6白藜芦醇对运动后大鼠肝组织丙二醛的影响
研究已经证实，剧烈运动产生ROS与自由基会破坏线粒体功能，使其失去作为电子传递链组分的能力，导致脂质过氧化发生并进一步造成氧化损伤[21]。丙二醛(MDA)是自由基诱导的脂质过氧化主要产物，也是评价运动诱导氧化应激最敏感的生物标志物之一[22]。白藜芦醇对运动后大鼠肝组织丙二醛的影响见图6。
由图6可以看出，与空白对照组(CG)组相比，3个不同剂量白藜芦醇组(L-ReG、M-ReG、H-ReG)MDA含量显著降低(p<0.05)，降低率分别为18.21%、24.14%、28.07%。这说明，白藜芦醇能减少自由基引起的脂质过氧化，保护肝细胞膜完整性并维持肝脏正常生理状态，进而提高运动耐力，促进疲劳恢复。
3结论
白藜芦醇具有抗疲劳作用，其能延长大鼠力竭跑步时间;降低BLA、BUN、肝组织中MDA含量;增加肝糖原、肌糖原以及肝组织中SOD、GPx、CAT含量。白藜芦醇抗疲劳作用机理其机制可能与以下因素有关：
1)白藜芦醇能降低代谢产物的堆积或快速清除代谢产物来延缓疲劳。
2)白藜芦醇能改善运动代谢控制和能量代谢活化，通过增加肝、肌肉糖原的储存来改善疲劳。
3)白藜芦醇能提高体内抗氧化酶活性，与内源性抗氧化剂形成协同抗氧化网络来降低氧化应激，发挥抗疲劳作用。
4)白藜芦醇能减少自由基引起的脂质过氧化，保护肝细胞膜完整性并维持肝脏正常生理状态，进而提高运动耐力，促进疲劳恢复。
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