胶体金免疫层析方法检测肺炎链球菌细胞壁多糖抗原

发布时间：2020-01-17

　　摘要：建立一种简易快速、特异性高的胶体金免疫层析法(GICA)用于检测肺炎链球菌细胞壁多糖抗原(C-Ps).根据双抗体夹心原理，将C-Ps单克隆抗体标记于胶体金颗粒，建立检测方法.实验结果表明该试纸条操作简便，肉眼于15,min内即可判定结果.试纸条对肺炎链球菌具有高度特异性，与百日咳鲍特菌、脑膜炎奈瑟氏菌等其他重要呼吸道致病菌无交叉反应.室温保存12个月，其检测结果无明显变化.与现行检测方法相比较，该研究制备的试纸条具有操作简便、检测快速、检出限低、特异性强、稳定性好等优点，其灵敏度和特异性分别为70%,和100%.而且与国外同类产品(美国BinaxNOW®产品)相比，灵敏度具有较高的一致性，而且特异性可达到100%,，性价比更高，为肺炎链球菌感染疾病的临床检测与早期诊断提供了一个新的手段.

　　关键词：肺炎链球菌;免疫层析试纸条;单克隆抗体

　　肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)是社区获得性肺炎、脑膜炎、中耳炎和败血症等的主要病因之一，在流感病患者中，常继发肺炎链球菌感染[1].在急性呼吸系统感染中肺炎链球菌造成的死亡率大约有30%，显著高于病毒造成的死亡率[2].

　　目前，用于检测肺炎链球菌的方法很多，包括细菌培养法、酶联免疫法(ELISA)和核酸扩增技术(PCR)等[3–6]，其中细菌培养法仍是目前检测肺炎链球菌感染的“金标准”，但传统的肺炎链球菌培养方法灵敏度太低，耗时较长，至少需要2,d以上，血培养阳性率仅10%,左右[7];PCR技术虽然可以对肺炎链球菌准确检测，但是操作复杂，需要特殊引物、实验仪器设备和专业人员，不能适应快速检测的要求.

　　免疫层析技术以胶体金作为示踪标志物，基于抗原抗体反应原理具有检测速度快、灵敏度高、特异性强、操作简便等特点，已经在临床检验、动植物免疫、食品安全等各领域得到广泛应用[8–9].

　　细胞壁多糖抗原(C-polysaccharide，C-Ps)是细菌细胞壁的组成成分，为肺炎链球菌各血清型所共有.针对细胞壁多糖抗原制备的单克隆抗体，具有特异性强、灵敏度高、交叉反应小的优势[10].本试纸条通过检测尿液中的细胞壁多糖抗原，达到对肺炎链球菌性感染快速诊断的目的，是一种简便快速的诊断方法.

　　1材料与方法

　　1.1材料菌株：肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、肺炎克雷白菌(Klebsiellapneumoniae)、百日咳鲍特菌(Bordetellapertussis)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitides)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、白色念珠菌(Moniliaalbican)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、血链球菌(Streptococcussanguis)，康希诺生物股份公司保藏.

　　尿样：含有10,ng/mLC-Ps的健康人群尿样的阳性尿样40份，健康人群阴性尿样40份.

　　试剂：弗氏不完全佐剂、PEG8000，Sigma公司;1640培养基、胎牛血清(FBS)，Gibco公司;氯金酸(AuCl3·HCl·4H2O)、柠檬酸三钠(C6H5Na3O7·2H2O)、三羟甲基氨基甲烷(C4H11NO3)，国药集团;牛血清白蛋白GHB034，杭州毕肯莱博生物科技有限公司;酶标羊抗小鼠、羊抗小鼠IgG，北京博奥龙免疫技术有限公司;肺炎链球菌细胞壁多糖标准品，美国SSI公司;对照试纸条为美国BinaxNOW®产品，美国英维利斯公司.

　　耗材：CN140硝酸纤维膜，赛多丽丝公司;GF-15金标垫、GF-60样品垫、AP270吸水纸、PVC底板、卡壳、铝箔袋，杭州毕肯莱博生物科技有限公司.

　　仪器：MK3酶标仪、311型CO2培养箱、加热磁力搅拌器，Thermo公司;HM3030划膜喷金仪、ZQ2002斩切机，上海金标生物科技有限公司;鼓风干燥箱，北京中科国仪科技有限公司.

　　1.2抗体的制备

　　分泌抗C-Ps单克隆抗体的细胞株5B3B9由本实验室保存.按照参考文献[11]中的方法并作改进.复苏细胞至对数期注射至经弗氏不完全佐剂致敏1周后的小鼠体内.收集腹水，离心取上清液，进行亲和纯化.

　　1.3胶体金及金标抗体的制备

　　按照参考文献[12]取0.01%,的氯金酸溶液100,mL在加热磁力搅拌器上加热至沸腾，加入1%,柠檬酸三钠水溶液1.2,mL，继续煮沸15,min，此时关闭加热功能继续搅拌，不再沸腾时停止搅拌.平衡至室温，恢复体积至100,mL.取胶体金100,mL，用0.2,mol/LK2CO3溶液调节至pH=8.5，将2,mg抗CPs单克隆抗体5B3B9加入胶体金溶液中，混匀后室温静置1,h，加入10%,BSA至质量分数为1%,，再加入10%,PEG8000至质量分数为0.2%,，混匀后室温静置1,h.7,000,r/min离心45,min，小心吸取上清液，用胶体金复溶液重悬沉淀至原标记体积的1/10.

　　1.4金标快速检测试纸条的组装

　　试纸条由吸水纸、硝酸纤维素样品垫和PVC底板组成.将抗C-Ps单克隆抗体5B3B9用10,mmol/LPB稀释成1,mg/mL，用划膜仪以1,µL/cm的上样量滑膜于硝酸纤维膜的检测线(T线)上，将羊抗鼠IgG用同样方法稀释成1,mg/mL，同样上样量滑膜于硝酸纤维膜的质控线(C线)上.37,℃温箱中干燥1,h后取出.最后将样品垫、金标结合垫、NC膜和吸水纸依次粘贴到PVC底板上，用斩切机切成4,mm宽的试纸条，装入检测卡中，加干燥剂密封于室温避光保存.

　　1.5检测及结果判定方法

　　将检测试纸条水平放置，取100,µL尿样滴加于加样孔，第15,min时判定结果，15,min后无效.结果判断方法如图1所示.

　　检测试纸条纤维素膜上出现2条红色线为肺炎链球菌阳性;仅出1条红色线(近吸水纸端)为阴性.如果质控线无显色条带，则视为试纸条失效.

　　1.6试纸条特异性实验

　　培养人体呼吸道、肠道等常见细菌至106～109,mL-1，将其裂解液作为待测样品，用同批次的试纸条按照检测及结果判定方法检测试纸条，分别对待测样品进行检测，并检测其重复性.

　　1.7试纸条最低检测限度实验

　　将C-Ps以生理盐水分别稀释至500、200、100、50、20、5、1、0,ng/mL制成待测样品，用同批次的试纸条按照检测及结果判定方法检测试纸条，对待测样品进行检测，并检测其重复性.

　　1.8试纸条稳定性实验

　　将试纸条密封存放于室温和37,℃，每隔1周取出，检测其阳性符合率、阴性符合率、特异性及灵敏度的变化.

　　1.9不同试纸条的比较

　　选取美国BinaxNOW®肺炎链球菌抗原检测试纸条进行对照检测.分别按照检测及结果判定方法对阳性样品及阴性样品进行检测，比对灵敏度及特异性.

　　2结果与分析

　　2.1抗C-Ps单克隆抗体评价

　　应用免疫双扩散法对抗C-Ps单克隆抗体进行评价.加入20,µL质量浓度为100,µg/mL的C-Ps标准品于中间孔中;分别加入20,µL质量浓度为100、50、25、12.5、6.25,µg/mL抗C-Ps单克隆抗体于1—5号孔中;加入20,µL生理盐水于6号孔中，作为阴性对照.结果如图2所示，抗体效价不低于6.25,µg/mL.图2抗C-Ps单克隆抗体免疫双扩实验结果Fig.2ResultsofdoubleimmunodiffusiontestforC-PsMab

　　2.2胶体金的质量鉴定

　　透射电镜下，制备的胶体金呈现球形，较均一、分散性较好(图3).紫外–可见分光光度计扫描表征结果如图4所示，其最高吸收峰在531,nm处，峰型较窄，与报道的40,nm胶体金的等离子共振吸收峰一致.

　　2.3试纸条检测结果

　　用试纸条分别检测阳性参考品、阴性参考品，其检测结果阳性明显清晰，阴性无假阳，阴阳性均能在15,min内显现，且检测结果可重复，如图5所示.

　　2.4试纸条特异性实验

　　将肺炎链球菌、肺炎克雷白菌、百日咳鲍特菌、脑膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌、大肠埃希氏菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、血链球菌等菌株分别培养至106～109,mL-1，将菌体裂解后用制备的试纸条分别进行检测，同时设立阴性对照，结果见表1.仅有肺炎链球菌呈现阳性反应，而对其他菌和阴性对照皆呈阴性，且结果可重复.

　　2.5试纸条最低检测限度实验

　　用生理盐水将C-Ps分别稀释至500、200、100、50、20、5、1、0,ng/mL，分别用标记为1—8号试纸条进行检测，结果如图6所示.质量浓度为1,ng/mL样品结果仍呈阳性且0,ng/mL结果为阴性，结果可重复.

　　2.6试纸条稳定性实验

　　试纸条于37,℃条件下保存21,d，检测其阴阳性符合率、灵敏度和特异性，结果符合标准;室温条件下保持12个月的试纸条，检测上述指标结果符合标准.

　　2.7自制试纸条与国外同类产品的比较

　　用自制试纸条和BinaxNOW®试纸条对肺炎链球菌C-Ps阳性参考品和阴性参考品同时检验的结果是一致的.

　　配制肺炎链球菌C-Ps阳性尿样40份(50%)，阴性样本40份(50%)，分别使用自制试纸条和BinaxNOW®试纸条进行灵敏度检测，结果见表2.

　　由表2可知：自制胶体金免疫试纸条检测阳性28份(35.0%)，阴性52份(65.0%);BinaxNOW®试纸条检测阳性40份(50%)，阴性40份(50%).自制胶体金试纸条灵敏度70.0%，特异性100%，阳性预测值100%，阴性预测值76.9%.BinaxNOW®试纸条灵敏度100%，特异性100%.自制胶体金试纸条与BinaxNOW®试纸条检测结果一致率Pa值为85.0%,，在检测结果无关联的假定下，期望一致率Pe值为50.0%,，Kappa值为70.0%,.

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　　3结论

　　本文以胶体金为示踪物，采用肺炎链球菌细胞壁多糖单抗，成功研制了肺炎链球菌免疫层析试纸条.试纸条最低检测限达到1,ng/mL，与百日咳鲍特菌、脑膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌、大肠埃希氏菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌等无交叉反应;试纸条37,℃保存21,d，或置于室温12个月，阴阳性符合率、特异性和灵敏度无变化，具有良好的稳定性;阳性结果对于快速诊断疾病，避免不必要的使用抗菌药物等都有极大的帮助.但是，抗原检测结果受很多因素的限制，包括灵敏度和特异性.本实验自制的胶体金试纸条灵敏度为70.0%,，特异性为100%,，与国外报道的胶体金试纸条灵敏度基本处于52%,～88%[13-14]的结果基本一致.该方法阳性预测值为100%,，阴性预测值为76.9%,，因此当该试剂盒检测为阳性时，基本可以确定为肺炎链球菌感染，而检测为阴性时则需要进一步确认.

　　与现有检测方法相比，本研究研制的试纸条具有简便、快速、准确的特点，兼有较特异性强、稳定性好、成本低的优点，可以在15,min内凭借肉眼判定结果，方便保存和运输，便于在社区医院和家庭中使用，而且作为辅助诊断主要工具，弥补了国产肺炎链球菌诊断试纸暂无市售的空缺，具有较高的市场潜力和应用前景.