HPLC法同时测定美洲大蠊提取物中9种核苷类成分
发布时间：2020-01-04
[摘要]目的：运用HPLC法同时测定美洲大蠊提取物中9种核苷类成分。方法：取美洲大蠊提取物冻干粉以流动相(2.5%甲醇)为溶剂进行溶解，配制成0.02mg﹒mL-1的供试品溶液，使用反相C18烷基硅胶柱(250mm×460mm，5μm)，以纯水:甲醇=97.5:2.5为流动相，体积流量1.0mL﹒min-1，检测波长254nm;柱温32℃，进样量为10μL为检测条件，对供试品溶液进行含量测定。结果：通过对3批美洲大蠊提取物冻干粉进行测定，结果显示胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鸟苷的平均含量分别为6.195mg﹒g-1、0.732mg﹒g-1、1.310mg﹒g-1、2.465mg﹒g-1、1.418mg﹒g-1、0.445mg﹒g-1、2.846mg﹒g-1、2.223mg﹒g-1、1.742mg﹒g-1，平均总含量为19.376mg﹒g-1。结论：所建立的HPLC方法在对同时测定美洲大蠊提取物中9种核苷类成分的测定中具简便、可靠、稳定、可行的特点，可用于康复新系列产品中间体的质量控制。
[关键词]美洲大蠊提取物;HPLC;核苷类;质量控制
美洲大蠊(PeriplanetaAmericanaL.)俗称蟑螂，为蜚蠊科(Blattaria)昆虫，在我国分布十分广泛，且药用历史悠久。蜚蠊入药首载于《神农本草经》，书中认为其“主血瘀，症坚、寒热”具“破积聚，喉咽痹”之功效。汉代末成书之《名医别录》中记载，其能“通利血脉”。至唐代，《唐本草》中记载有“食之下气”之内容。明代本草著作《本草纲目》认为其“主淤血，症坚，寒热”，功能“下气，利血脉”[1]。目前中医临床一般认为其具有健脾消疳，活血通脉，利水消肿生肌等功效。上世纪70年代以来，对美洲大蠊进行的基础研究表明，美洲大蠊的不同活性部位具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、提高机体自身免疫力、促进伤口愈合、血管新生、扩张血管、改善血液微循环等作用[2]。
近年来，以美洲大蠊制成的单味动物药制剂康复新系列产品在临床上得到了广泛应用，且于临床治疗各种原因引起的皮肤及黏膜创伤疗效显著。研究表明，美洲大蠊的主要化学成分由向外释放的化学成分和体内存在的化学成分两大类组成[2]，其中体内所含成分以氨基酸类和核苷类含量最为丰富[3]。目前在各地方标准中对康复新中间体即美洲大蠊提取物的质量评价主要集中于对其所含有的氨基酸进行检测，而同样含量丰富的核苷类成分并未被纳入各地方标准[4~5]。将核苷类成分与氨基酸类成分一起作为美洲大蠊提取物的质量评价指标将更有利于提高相关产品质量。基于此，本研究采用HPLC方法，以胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鸟苷9种核苷类物质为研究对象，对三批次美洲大蠊提取物中核苷类成分进行了定量测定，以期为中药大品种康复新的质量控制提供新的思路与方法，为有效提高相关中药制剂的质量提供参考。
1仪器和材料
1.1原料与试剂
美洲大蠊提取物冻干粉(好医生攀西药业有限公司提供，批号：hys16120501);对照品尿嘌呤(批号：wkq15120505)、次黄嘌呤(批号：wkq16091402)、腺嘧啶(批号：wkq16090203)、胸腺嘧啶(批号：wkq16041501)、肌苷(批号：wkq16090505)、鸟苷(批号：wkq16090703)、腺嘧啶(批号：wkq15120901)、胞苷(批号：wkq16092701)、尿苷(批号：wkq16083105)均购于四川省维克奇生物科技有限公司，纯度均大于99%。甲醇为色谱纯(美国Fisher公司);试剂均为分析纯。
1.2仪器
LC-20303D型液相色谱仪(日本，岛津公司);BT40A型超声波清洗器(成都市，雅源科技有限公司);N-1100型旋转蒸发仪(上海市，泉杰仪器有限公司);UPK-1-10T型超纯水器(四川，优普超纯科技有限公司);HX1002T型电子天平(慈溪市，天东衡器厂);DFY-200C型粉碎机(上海市，利闻科学仪器有限公司)。
2方法与结果
2.1对照品溶液的配制
分别取胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘧啶、肌苷、鸟苷对照品适量，精密称定，分别置于9个不同的容量瓶中，加入2.5%甲醇配制成质量浓度为胞嘧啶3.11mg﹒mL-1、尿嘧啶4.32mg﹒mL-1、胞苷3.54mg﹒mL-1、次黄嘌呤3.92mg﹒mL-1、尿苷3.89mg﹒mL-1、胸腺嘧啶2.72mg﹒mL-1、腺嘧啶3.63mg﹒mL-1、肌苷3.02mg﹒mL-1、鸟苷3.04mg﹒mL-1的单一对照品储备液。分别精密吸取适量各储备液置于同一个容量瓶中，用2.5%甲醇定容，摇匀，配制成质量浓度为胞嘧啶0.311mg﹒mL-1、尿嘧啶0.432mg﹒mL-1、胞苷0.354mg﹒mL-1、次黄嘌呤0.392mg﹒mL-1、尿苷0.389mg﹒mL-1、胸腺嘧啶0.272mg﹒mL-1、腺嘧啶0.363mg﹒mL-1、肌苷0.302mg﹒mL-1、鸟苷0.304mg﹒mL-1的混合对照品溶液，备用。
2.2供试品溶液的制备
精密称取美洲大蠊提取物冻干粉1g，加入流动相溶液(2.5%甲醇)定容至50mL容量瓶，取适量溶液以0.45μm微孔滤膜滤过，置于进样瓶中，待测。
2.3测定波长的选择
取混合对照品溶液适量、美洲大蠊提取物样品溶液以水为参比溶液，按照紫外可见分光光度法(中国药典2015版三部通则0401)，在200～600nm波长范围内进行紫外光谱扫描。结果在254nm处有最大吸收，故选择254nm为检测波长。
2.4HPLC色谱条件
Agilent反相C18烷基硅胶柱(美国安捷伦公司，250mm×460mm，5μm);检测波长：254nm;柱温：32℃;进样量：10μL;流动相：水:甲醇=97.5:2.5;体积流量：1.0mL﹒min-1。
在此色谱条件下得到了混合对照品与美洲大蠊提取物供试品溶液色谱图分别见图1与图2。
2.5方法学考察
2.5.1标准曲线与线性范围取混合对照品溶液0.5,1.5,2.5,5,7.5,10mL分别置于6个10mL容量瓶中，之后加入2.5%甲醇定容，摇匀。分别将不同浓度的对照品溶液按“2.2”项下要求的条件，按照质量浓度由低到高分别进样，对峰面积进行测定(混合对照品色谱图见图1)。横坐标为进样质量浓度(mg﹒mL-1)，纵坐标为峰面积，进行线性回归，得各指标成分的线性回归方程，结果见表1。由表中数据可知，各核苷类成分的R2在1~0.9996范围内，R2>0.999，故认为各成分在其所在的浓度范围线性关系良好。
2.5.2精密度试验精密吸取混合对照品溶液10μL，按“2.2”项下色谱条件测定，连续进样6次，记录峰面积，以峰面积计算RSD。结果见表2。由表中数据可知，各组分色谱峰的保留时间波动在0.3min内，各核苷类成分峰面积的RSD在1.40%~3.26%范围内，表明仪器精密度良好。
2.5.3重复性试验 精密量取供试品溶液(批号20170912A)1mL，制备6份供试品溶液，取同一批样品，按“2.4”项下方法平行制备6份，分别进样10μL，每份供试品重复进样3次，按“2.2”项下要求测定含量，计算含量平均值及RSD。结果见表3。由表中数据可以，供试品中各核苷类成分含量的RSD在1.57%~3.22%范围内，表明该方法重复性良好。
2.5.4稳定性试验精密吸取供试品溶液10μL，按“2.2”项下的色谱条件分别于0,2,4,8,12,24,48h进行，记录峰面积，以峰面积计算RSD。结果见表4。由表中数据可知6种核苷类成分峰面积的RSD在1.17%~2.63%范围内，供试品溶液在48h内稳定性良好。
2.5.5加样回收率试验 精密量取供试品溶液1mL，共9份，再精密加入混合对照品溶液1,2,3,5mL，按照“2.2”项下色谱条件进行测定，每份重复进样3次，测定含量，计算含量平均值及RSD。结果见表5。
实验结果表明，每种核苷成分的平均回收率均在95%~105%范围内，且各回收率的RSD在2.37~3.8%范围内，表明该方法回收率良好。
2.6样品含量的测定
取3批美洲大蠊提取物冻干粉，按“2.4”项下要求制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定9种核苷类成分的含量(美洲大蠊提取物溶液色谱图见图2)，计算平均含量及平均总含量(结果见表6)。由表中数据可知3批美洲大蠊提取物冻干粉中胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鸟苷的平均含量分别为6.195mg﹒g-1、0.732mg﹒g-1、1.310mg﹒g-1、2.465mg﹒g-1、1.418mg﹒g-1、0.445mg﹒g-1、2.846mg﹒g-1、2.223mg﹒g-1、1.742mg﹒g-1，平均总含量为19.376mg﹒g-1，拟规定美洲大蠊提取物冻干粉的胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鸟苷平均含量分别不低于4.96mg﹒g-1、0.59mg﹒g-1、1.05mg﹒g-1、1.97mg﹒g-1、1.13mg﹒g-1、0.36mg﹒g-1、2.28mg﹒g-1、1.78mg﹒g-1、1.39mg﹒g-1，且9种核苷类成分平均总含量不低于15.5mg﹒g-1(按平均含量的80%计算)。
3讨论与总结
康复新系列产品为美洲大蠊成虫干燥个体提取物制成的单方制剂，收载于卫生部药品标准《中药成方制剂》。中医临床认为其具有通利血脉、养阴生肌的功效。目前多将其应用于口腔溃疡、胃出血、胃溃疡、十二指肠溃疡等症[6]。目前，由于美洲大蠊的饲养基地较多，极易导致不同厂家所使用的康复新制剂原料存在较大的差异。多个地方标准，对康复新系列产品的原料及中间体多通过测定总氨基酸含量来控制其质量[7]，然而单一成分的检测往往难以达到科学、全面控制其质量的目的。因此，亟需引入更多的化学成分作为美洲大蠊提取物康复新中间体的质量控制指标。目前从美洲大蠊体内分离出来的化学成分主要有氨基酸和肽、核苷、多糖、多元醇、甾体和萜类成分，近年又有学者从中分得生物碱、黄酮和异香豆素等活性物质，但目前用于临床的美洲大蠊制剂的有效成分尚不明确，有待进一步的研究与发现。
核苷类物质被公认为美洲大蠊提取物的主要化学成分之一[3]。通过研究，我们对3批美洲大蠊提取物中的9种常见核苷类成分进行含量测定，分别为胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘧啶、肌苷、尿苷。且后期相关实验结果显示不同产地美洲大蠊提取物9种核苷类成分含量差异较大。
本研究建立了HPLC分析方法对美洲大蠊提取物中9种核苷类成分含量进行测定，且稳定性和重现性好，该方法为美洲大蠊相关产品的质量控制提供了技术手段。
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