HPLC法同时测定广山楂中3种活性成分含量
发布时间：2020-01-04
摘 要：探究炮制对广山楂中儿茶素、柚皮苷、根皮苷 3 种成分含量的影响。方法采用 SHIMADZU VP-ODS C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：乙腈(A)-0.2 %磷酸水溶液(B)，梯度洗脱;流速 0.8 mL/min;紫外检测波长为 285 nm;柱温 30 ℃。结果表明：各炮制品中儿茶素含量如下：炒焦品(14.23 mg/g)>盐炙品(12.53 mg/g)>炒黄品(7.35 mg/g)>炒炭品(7.23 mg/g)>酒炙品(5.12 mg/g)>生品(3.71 mg/g);柚皮苷含量为：酒炙品(6.18 mg/g)>炒焦品(5.35 mg/g)>盐炙品(4.66 mg/g)>炒黄品(3.26 mg/g)>生品(2.54 mg/g)>炒炭品(1.87 mg/g)。根皮苷含量依次是：盐炙品(0.98 mg/g)>炒焦品(0.82 mg/g)>酒炙品(0.76 mg/g)>炒黄品(0.43 mg/g)>生品(0.37 mg/g)>炒炭品(0.27 mg/g)。不同炮制方法对广山楂中成分产生一定影响，盐炙等炮制方法可提高广山楂中儿茶素、柚皮苷、根皮苷含量，炒炭后则使柚皮苷、根皮苷含量降低。
关键词：广山楂;炮制方法;儿茶素;柚皮苷;根皮苷;高效液相色谱法
广山楂为蔷薇科苹果属植物台湾林檎 Malus- doumeri(Bois.)Chev. 或光萼林檎 Malusleiocalyca S.Z. Hunag 的干燥成熟果实，其性味酸、甘、涩，微温，归脾、胃、肝经，具有消食健胃，行气散瘀的功效，可用于肉食积滞，胃脘胀满，泻痢腹痛，瘀血经闭，产后瘀阻，心腹刺痛，疝气疼痛，高脂血症等。广山楂在广西地区作为临床常用药物，已有 90 多年历史，有生用、炒黄、炒焦、炒炭、酒炙、盐炙等多种炮制方法[1]。广山楂中含有黄酮、有机酸、萜类、甾醇类等多种成分[2-3]。现代药理研究表明，儿茶素具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等作用[4-8]，柚皮苷则具有促进骨细胞增殖和分化成熟[9-10]、抑制骨关节炎软骨细胞凋亡作用[11]等多方面生物活性。根皮苷具有抗癌、抗病毒、抗氧化等作用[12-15]。近年来，有学者比较了不同产地的广山楂中芦丁[ 16]、金 丝桃苷含 量[17]，但对于广山楂及其不同炮制品中儿茶素、柚皮苷、根皮苷等 3 种活性成分含量的研究，鲜见有文献报道。基于此种情况，本研究拟对广山楂中上述 3 种主要化学成分含量进行研究，为探讨广山楂及其炮制方法的科学性及临床合理使用提供科学参考。
1 材料
1.1 仪器
LC-1260AT 高效液相色谱分析仪 (G1315D DAD 检测器，G1311C 四元泵，G1329B 自动进样器，G1316A 柱温箱，Agilent ChemStation 色谱工作站)：美国安捷伦公司;SHIMADZU VP-ODS C18 柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)：岛津-GL(上海)商贸有限公司;SQP 型电子分析天平：德国赛多利斯科学仪器有限公司。
1.2 药材
广山楂采集于桂林市平乐县，经广西中医药大学梁子宁副教授鉴定，为蔷薇科苹果属植物台湾林檎 Malusdoumeri(Bois.)Chev.的干燥成熟果实。
1.3 试剂
儿茶素、柚皮苷、根皮苷对照品(纯度质量分数> 98 %)：成都艾特姆生物科技有限公司;甲醇、乙腈(色谱纯)：赛默飞世尔(中国)有限公司;实验用纯净水，其他试剂均为分析纯。
2 试验方法
2.1 广山楂不同炮制品
制备生品：取广山楂饮片，放入 40 ℃的烘箱中烘 10 h，取出放凉，即得。
炒黄品：取净广山楂饮片 100 g，置预热的电炒锅内，中火(1 500 W)加热，连续加热 5 min，炒至表面浅黄色，取出，晾凉，称重，即得，收率为 94.29 %(收率/%= 炮制后合格品质量(g)/生品质量(g)×100)。
炒焦品：取净广山楂饮片 100 g，置预热的电炒锅内，中火(1 500 W)加热，连续加热 6 min，炒至表面焦黄色，略见焦斑，取出，晾凉，称重，即得，收率为 92.86 % (收率/%=炮制后合格品质量(g)/生品质量(g)×100)。
炒炭品：取净广山楂饮片 100 g，置预热的电炒锅内，武火(2 100 W)加热，连续加热 9 min，炒至表面焦黑色，内部焦褐色，取出，晾凉，称重，即得，收率为 75 % (收率/%=炮制后合格品质量(g)/生品质量(g)×100)。
酒炙品：取净广山楂饮片 100 g ，加入黄酒 20 g (加适量水稀释)，闷润，待溶液吸尽后，置预热的电炒锅内，武火(600 W)加热，连续加热 10 min，炒至表面近干，取出，晾凉，称重，即得，收率为 95.20 %(收率/%=炮制后合格品质量(g)/生品质量(g)×100)。
盐炙品：取净广山楂饮片 100 g，加入食盐 2 g，加适量水稀释，闷润，待溶液吸尽后，置预热的电炒锅内，武火(600 W)加热，连续加热 10 min，炒至表面近干，取出，晾凉，称重，即得，收率为 98.7 %(收率/%=炮制后合格品质量(g)/生品质量(g)×100)。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取儿茶素对照品 242.0 mg、柚皮苷对照品 8.0 mg、根皮苷对照品 13.3 mg，置于同一 50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度。精密量取上述对照品溶液 0.5、1.5、2.5、5、7.5、10 mL 至量瓶中，加甲醇定容至 10 mL，即得。
2.3 供试品溶液的制备
分别精密称取各样品粉末(65 目)1.0 g，精密加入甲醇 20 mL，称重，回流提取 2 h，放冷，补足重量，过滤，取滤液适量，离心冷藏备用。
2.4 色谱条件
色 谱 柱 SHIMADZU，VP -ODS C18 柱 (250 mm ×4.6 mm，5μm);流动相：乙腈(A)-0.2 %磷酸水溶液(B)，梯度洗脱程序(0～5 min，6 %～6 % B，5.1 min～15 min， 6 %～10 % B;15.1 min～27 min，10 %～17 % B;27.1 min～ 50 min，17 %～38 % B ;50.1 min ～60 min，38 %～52 % B);流速 0.8 mL/min;紫外检测波长为 285 nm;柱温 30 ℃;进样量 10 μL。
2.5 线性关系的考察
分别精密吸取儿茶素、柚皮苷、根皮苷混合对照品溶液 10 μL 注入高效液相色谱仪，依法测定，以对照品的进样量(μg)为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，即得。
2.6 精密度试验
精密吸取“2.2”对照品溶液 10 μL，在“2.4”项色谱条件下，连续进样 6 次，计算各峰峰面积 RSD。
2.7 重复性试验
精密称取同一样品(生品)粉末(65 目)1.0 g，平行 6 份，按“2.3”项下的制备方法制备溶液，依法测定，即得。
2.8 稳定性试验
精密吸取广山楂(生品)溶液 10 μL，分别在 0、1、 4、8、12、24 h 进样，分别考察 3 种成分的稳定性，即得。
2.9 加样回收率试验
精密称取已知含量样品(生品)粉末 6 份，每份约 0.5 g，精密称定。采用加样回收试验，分别精密加入适量儿茶素、柚皮苷、根皮苷对照品，精密称定。依“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下条件测定，即得。
2.10 样品含量测定
取各炮制品粉末 (65 目) 各 1.0 g，平行 3 份，按 “2.3”项下制备各供试品溶液，分别吸取各样品 10 μL，依法进样进行测定，计算各自样品含量。
3 结果与分析
3.1 线性关系的考察
按照“2.5”项下方法，进行线性关系考察，结果见表 1。结果表明，各成分在各自浓度范围内呈良好线性关系。
3.2 精密度试验
按照“2.6”项下方法进行的精密度试验，结果见表 2。
结果儿茶素、柚皮苷、根皮苷峰面积的 RSD 分别为 1.33 %、1.65 %、2.81 %，表明该方法测定结果的仪器精密度良好。
3.3 重复性试验
重复性试验结果见表 3。结果儿茶素含量为 3.70 mg/g，RSD 为 0.95 %;柚皮苷含量为 2.54 mg/g，RSD 为 2.35 %;根皮苷含量 0.37 mg/g，RSD 为 0.88 %，结果表明本研究建立方法重复性良好。
3.4 稳定性试验
稳定性试验结果见表 4。结果儿茶素、柚皮苷、根皮苷峰面积 RSD 分别为 1.34 %、1.68 %、2.56 %，试验结果表明供试品溶液在 24 h 内稳定。
3.5 加样回收率试验
加样回收试验结果见表 5。
结果如表 5 所示，结果儿茶素、柚皮苷、根皮苷的平均回收率分别是 100.34 %、100.19 %、99.89 %;RSD 依次为 0.85 %、1.04 %、1.61 %。
3.6 样品含量测定
广山楂不同炮制品儿茶素、柚皮苷、根皮苷的含量测定结果见表 6。
由表 6 可以看出各炮制品中儿茶素含量如下：炒焦品(14.23 mg/g)>盐炙品(12.53 mg/g)>炒黄品(7.35 mg/g)>炒炭品(7.23 mg/g)>酒炙品(5.12 mg/g)> 生品(3.71 mg/g);柚皮苷含量为：酒炙品(6.18 mg/g)> 炒焦品 (5.35 mg/g)>盐炙品 (4.66 mg/g)>炒黄品(3.26 mg/g)>生品(2.54 mg/g)>炒炭品(1.87 mg/g)。根皮苷含量依次是：盐炙品(0.98 mg/g)>炒焦品(0.82 mg/g)> 酒炙品(0.76 mg/g)>炒黄品(0.43 mg/g)>生品(0.37 mg/g) >炒炭品(0.27 mg/g)。广山楂不同炮制品 HPLC 色谱图见图 1。
由图 1 可以看出，在广山楂各不同炮制品在色谱图相应的位置均能检测到儿茶素、柚皮苷和根皮苷的对照品色谱峰，结果表明广山楂的不同炮制品中均含有上述 3 种活性成分，且得到了较好的分离，相邻峰间分离度均大于 1.5。
4 结论
广山楂是一种以果实为入药部位，也是一种药食两用的药材，在广西地区作山楂使用已有近百年历史。目前，在现行的广西壮族自治区中药饮片炮制规范(2007)中收载了炒黄、炒焦、炒炭等多种炮制方法[1]，但尚未建立广山楂饮片指标性成分含量测定方法与标准，对其饮片质量控制将产生不利影响。因此本研究首次采用 HPLC 比较了广山楂及其不同炮制品中儿茶素、柚皮苷、根皮苷 3 种成分含量。由表 6 可看出，各炮制品中儿茶素含量高低顺序为：各炮制品中儿茶素含量如下：炒焦品(14.23 mg/g)>盐炙品(12.53 mg/g)>炒黄品(7.35 mg/g)>炒炭品(7.23 mg/g)>酒炙品(5.12 mg/g)> 生品(3.71 mg/g);进一步分析广山楂不同炮制品中儿茶素含量，发现不同炮制品中尤以炒焦和盐炙法炮制后含量为高，分别约为生品的 3.8 倍和 3.4 倍;炒黄品、炒炭品、酒炙品含量分别为生品 1.98、1.94、138 倍。该结果说明，炮制可提高儿茶素含量。这可能与糖类成分在加热的条件，转化形成儿茶素有关，其转化机理有待进一步研究。柚皮苷含量为酒炙品>炒焦品>盐炙品>炒黄品>生品>炒炭品。根皮苷含量则为盐炙品>炒焦品>酒炙品>炒黄品>生品>炒炭品。经对比分析发现，酒炙、盐炙、炒焦、炒黄的炮制方法均提高柚皮苷、根皮苷含量，生品次之，分析原因，可能与柚皮苷和根皮苷同属于黄酮苷类物质，药物中存在的相应水解酶使部分苷类成分发生水解，从而使生品含量较低。而炒炭法炮制后样品含量最低，这可能与其炒炭时温度高、时间长有关。该研究结果提示加热和加辅料炮制可起到一定的“杀酶保苷”作用，但此 3 种化学成分含量的变化是否是其传统功效发生改变的物质基础，值得进一步结合相关的药理药效指标进行深入研究，以期为其不同炮制品的临床合理使用提供科学依据。
本研究结果表明不同炮制方法对广山楂的 3 种化学成分产生了一定影响，盐炙等炮制方法可提高样品中儿茶素、柚皮苷、根皮苷含量，炒炭法则使柚皮苷、根皮苷含量降低，可为广山楂的研究提供一定参考。
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