HPLC法测定盐酸考尼伐坦的有关物质

发布时间：2020-01-03

　　摘要:目的建立高效液相色谱法测定盐酸考尼伐坦的有关物质。方法采用十八烷基键合硅胶色谱柱(250mm×4.6mm，5μm);流动相A相为0.03mol/L磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节pH至5.7)，B相为乙腈，梯度洗脱;流速为1.0mL·min-1;检测波长为220nm。结果主峰与各杂质色谱峰均能基线分离。盐酸考尼伐坦、杂质A、B、C、D、E、F分别在0.0668～4.45、0.0233～3.88、0.0925～3.70、0.0204～4.07、0.0312～4.16、0.127～4.24、0.138～4.59mg·L-1浓度范围内均与峰面积呈良好的线性关系(r>0.999);杂质A、B、C、D、E、F的平均回收率分别为97.9%、99.2%、99.6%、100.6%、98.7%、100.1%，RSD%分别为1.43%、2.47%、2.18%、1.20%、2.56%、1.50%(n=9)。结论本文所建立的HPLC法可以用于盐酸考尼伐坦有关物质的测定。

　　关键词:盐酸考尼伐坦;有关物质;高效液相色谱法

　　盐酸考尼伐坦(conivaptanhydrochloride，结构式见Fig.1)属于精氨酸血管加压素V1a和V2受体的一种非肽类双重抑制剂[1]，其制剂盐酸考尼伐坦注射液，由日本安斯泰来公司首次开发研究，并于2005年在美国成功上市。该药在临床上主要是用于血容量正常的低钠血症住院病人的治疗[2]。目前，盐酸考尼伐坦在国内尚未批准上市和使用，其有关物质测定方法也未见有相关报道。本文参照盐酸考尼伐坦相关文献溶解度试验项[3]色谱条件，同时结合本公司原料合成工艺路线建立了盐酸考尼伐坦有关物质(结构式见图1)高效液相色谱法(HPLC)测定法。经方法学验证表明:本文作者所建立的有关物质方法简便专属性强、灵敏度高，可以用于盐酸考尼伐坦有关物质的测定。

　　1仪器与材料

　　Agilent1100series高效液相色谱系统(包括G1312A输液泵、G1316A柱温箱、G1315BDAD检测器及Chemstation32色谱工作站，美国Agilent公司)，UV-1800型紫外-可见分光光度仪(日本shimadzu公司)。

　　盐酸考尼伐坦对照品(含量质量分数99.3%，批号:20140114，为原料药精制品)，盐酸考尼伐坦原料药(批号:20131115、20140520、20140530、20140602)，杂质B(含量质量分数95.3%，批号:20130812)、杂质C(含量质量分数99.5%，批号:20130823)、杂质D(含量质量分数99.1%，批号:20130906)(由合肥信风科技开发有限公司提供)，杂质A(含量99.0%，批号:30180116，国药集团化学试剂有限公司)，杂质E(纯度质量分数98.6%，批号:K18G111201，美国SincoPharmachem公司)，杂质F(纯度质量分数94.4%，批号:K18F111201，美国SincoPharmachem公司)，乙腈(色谱纯，瑞典Oceanpak公司)，磷酸氢二钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，磷酸(色谱纯，天津市光复精细化工研究所)，水(纯化水，安徽乐泉饮品有限公司)。

　　2方法与结果

　　2.1色谱条件

　　色谱柱:Diamonsil?C18(250mm×4.6mm，5μm);流动相:A相为0.03mol·L-1磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节pH至5.7)，B相为乙腈，梯度洗脱:0～20min，20%→60%B项，20～50min，60%B项，50～52min，60%→20%B项，52～60min，20%B项;流速:1.0mL·min-1;柱温40℃;检测波长:220nm;进样量:20μL。记录色谱图至主峰保留时间的3倍。

　　2.2溶液的制备

　　系统适用性溶液:分别取盐酸考尼伐坦对照品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F各适量，精密称定，分别加溶剂[乙腈-水(体积比20∶80)]溶解并稀释制成200mg·L-1的溶液作为储备液;再分别精密量取各储备液适量，加溶剂稀释制成20mg·L-1的溶液作为系统适用性溶液。

　　供试品溶液与对照溶液:取盐酸考尼伐坦原料药适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成200mg·L-1的供试品溶液和1mg·L-1的对照溶液。

　　2.3检测波长的选择

　　取“2.2”条下系统适用性溶液的储备液，加溶剂稀释至一定浓度，摇匀(盐酸考尼伐坦、杂质A、杂质B、杂质D、杂质F为每1mL中约含10μg、杂质C与杂质E为每1mL中约含5μg的溶液)。照紫外-可见分光光度法测定，在200～400nm波长范围内进行紫外扫描。试验结果表明:盐酸考尼伐坦、杂质B、杂质D及杂质E在240nm波长附近有最大吸收，同时在220nm末端吸收波长处均有较大吸收值;杂质A、杂质C及杂质F均只在220nm波长附近有最大吸收，综合考虑选用220nm作为本品有关物质的测定波长。

　　2.4盐酸考尼伐坦与其各杂质峰的定位及系统适用性试验

　　取“2.2”条下系统适用性溶液的储备液(用于杂质定位)及系统适用性溶液，分别进样分析，记录色谱图。按从左到右色谱峰的出峰顺序分别为杂质A(4.3min)、杂质C(6.4min)、杂质D(12.2min)、杂质B(16.2min)、盐酸考尼伐坦(19.7min)、杂质E(26.0min)及杂质F(29.7min);各杂质峰相对于盐酸考尼伐坦峰的相对保留时间分别为0.22、0.32、0.62、0.82、1.32及1.51;盐酸考尼伐坦与相邻杂质B、杂质E的分离度约为11.9和17.5，主峰前后及各杂质间分离度均能满足基线分离(分离度R>1.5);理论板数以盐酸考尼伐坦峰计不低于5000。系统适用性试验色谱图见图2。

　　2.5方法学验证

　　2.5.1专属性试验

　　取盐酸考尼伐坦原料药约10mg，共6份，精密称定，分置50mL量瓶中，各加入溶剂适量使溶解后，分别操作如下:a.加入1mol·L-1盐酸溶液2mL，80℃水浴17h，用碱中和后得酸破坏溶液;b.加入1mol·L-1氢氧化钠溶液1mL，80℃水浴17h，用酸中和后得碱破坏溶液;c.加入30%过氧化氢溶液2mL，室温放置30h，得氧化破坏溶液;d.置90℃水浴加热48h，得高温溶液破坏;e.置4500±500lx冷白光下放置24h，得光照溶液破坏;f.置紫外灯下放置24h，得紫外溶液破坏;g.另取1份，置50mL量瓶中，在150℃下热破坏15h，得高温固体破坏样品;h.分别取4500±500lx冷白光;i.紫外灯照射10天后的原料药各10mg，精密称定，置50mL量瓶中，分别作为光照固体破坏样品和紫外光固体破坏样品;上述固体破坏样品均加入溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀[4-5]。按照上述有关物质测定方法分别进样，记录色谱图见图3。

　　各项试验结果表明:盐酸考尼伐坦在上述各强制降解条件下，除强酸、强碱溶液破坏下有较大程度的降解杂质产生，其它条件下均保持相对稳定;强酸降解产生的主要杂质为杂质C和杂质D，强碱降解产生的主要杂质为杂质D;主峰前后及各降解杂质与主峰的分离度均能达到基线分离。DAD检测器光谱显示，主峰纯度因子均大于阈值设置值995;各强制降解条件下物料平衡值均在95%～105%内。

　　2.5.2检测限、定量限及线性范围

　　取“2.2”条下系统适用性溶液盐酸考尼伐坦及各杂质的储备液，加溶剂逐级稀释至LOQ(各色谱峰的信噪比S/N约10倍)和LOD(各色谱峰的信噪比S/N约3倍)浓度，摇匀，分别作为定量限和检测限溶液;以溶剂逐级稀释储备液制得一系列线性浓度标准溶液(LOQ为标准曲线起始浓度)。分别取上述溶液进样，以各组分的峰面积A作为纵坐标，溶液浓度ρ(mg·L-1)作为横坐标，按照最小二乘法进行线性回归。结果见表1。试验结果表明:本品在上述条件下，大于0.03%限度的杂质均可被检出，而大于0.05%限度的杂质均可以定量测定[6];各组分在一定范围内呈良好的线性关系;校正因子F(主成分峰曲线斜率/各杂质峰曲线斜率)除杂质C与杂质E外，均在范围0.9～1.1内，按从严要求，所有杂质的相对校正因子F值均按1.0计算，故本品有关物质可采用不加校正因子的主成分自身对照法来计算结果。

　　2.5.3回收率试验

　　取盐酸考尼伐坦原料药(批号:20131115)约200mg，精密称定，置1000mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释制成200mg·L-1的溶液，作为原料溶液;精密量取溶剂1mL置10mL量瓶中，加原料溶液稀释至刻度，摇匀，作为本底溶液;分别取杂质A、B、C、D、E、F各适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成30mg·L-1的溶液作为各杂质储备液;再分别精密量取1mL置100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液;精密量取各杂质储备液0.8mL(80%)、1.0mL(100%)及1.2mL(120%)，各3份，分置10mL量瓶中，各加溶剂稀释至刻度，摇匀;再分别精密量取1mL置10量瓶中，加原料溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别进样，记录色谱图，照外标法计算各杂质的回收率。结果显示:杂质A、B、C、D、E、F的平均回收率分别为97.9%、99.2%、99.6%、100.6%、98.7%、100.1%，RSD%分别为1.43%、2.47%、2.18%、1.20%、2.56%、1.50%(n=9)。

　　2.5.4重复性试验

　　取盐酸考尼伐坦原料药(批号:20131115)，共6份，按“2.2”条下方法配制供试品溶液，分别进样，按主成分峰面积归一化计算本品有关物质。结果显示:6份样品有关物质平均值为0.121%，RSD为1.54%，均未检出已知杂质，未知杂质的检出量均无明显差异，表明本方法重复性良好。

　　2.5.5溶液稳定性试验

　　取盐酸考尼伐坦原料药(20131115)，共2份，按“2.2”条下方法配制避光和不避光两种供试品溶液，在室温条件下，与0、2、4、6、8h分别进样，按主成分峰面积归一化计算本品有关物质。结果显示:本品在8h内避光与不避光条件下测得的有关物质平均值为0.116%、0.117%，RSD为2.06%、0.94%，均未检出已知杂质，未知杂质的检出量均无明显差异，表明本品在8h内溶液稳定性良好，避光与不避光条件下有关物质测定结果保持一致。

　　2.5.6耐用性试验

　　按“2.2”条下方法配制供试品和系统适用性溶液，同时取溶剂，在改变波长(±5nm)、流速(±0.2mL·min-1)、色谱柱(不同品牌3根)、pH值(±0.2)及柱温(±5℃)的条件下分别进行试验。试验结果表明:在上述各项试验条件下，溶剂无异常峰产生，系统适用性溶液中盐酸考尼伐坦与各杂质均能有效分离，按主成分峰面积归一化计算，供试品溶液中有关物质的结果无明显差异。表明本方法耐用性良好。

　　2.6三批样品有关物质测定

　　按“2.2”条下方法配制系统适用性、供试品及对照溶液，分别进样。按照不加校正因子的主成分自身对照法计算本品有关物质。结果见表2。典型色谱图见图4。

　　3讨论

　　a.根据本公司开发的合成工艺路线，将起始原料(杂质B)、中间体(杂质C、D)、反应副产物甲苯-4-磺酸(杂质A)以及反应可能会产生的工艺杂质(杂质E、F)作为已知杂质来进行研究。在专属性试验强酸、强碱的破坏条件下，检出了较大的杂质C和杂质D，均与主成分峰分离良好。

　　b.本品在流动相条件选择时，在文献条件的基础上，考虑到等度洗脱会造柱效和各成分峰检测灵敏度的降低，从而影响有关物质的检出，故将等度洗脱优化为梯度洗脱。同时为保护色谱柱，延长其使用寿命，将A相中的磷酸氢二钠盐浓度由0.05mol·L-1降至0.03mol·L-1，两者进行比较并无明显差异，各成分峰均能满足基线分离，系统适用性良好。

　　c.本品有关物质采用220nm作为检测波长，除采用紫外-可见分光光度法初步确定后，在高效液相色谱法专属性试验项下，增加了220nm与240nm的杂质对比研究。试验结果表明，样品经各条件强制降解后，在240nm下检出的杂质个数相对较少，杂质总和较小，且主成分峰的响应值要低于220nm项下，故综合考虑仍选择220nm作为本品有关物质检测波长。

　　HPLC法测定盐酸考尼伐坦的有关物质相关期刊推荐：《沈阳药科大学学报》(月刊)创刊于1957年，是由沈阳药科大学主办的药学类科技期刊。1987年被国家科委批准为国家级刊物，现已被美国化学文摘(CA)、俄罗斯文摘杂志(AJ)、日本科学技术社数据库、中国药学文摘等文摘性杂志所收录。目前主要收稿方向：药剂、药物化学、药物分析、药理、生物药学、医药经济、综述等。有投想投稿的，可以咨询在线编辑。