除草剂莠去津降解菌的筛选及降解效果

发布时间：2020-01-02

　　摘要: 除草剂莠去津超量或不正确使用对土壤环境、下茬作物、各种动物等都会产生不利的影响，而且莠去津的残效期比较长，不易被降解，因此，获得具有高效降解莠去津能力的细菌就显得非常重要。利用细菌培养基筛选技术对莠去津降解菌进行筛选，并研究细菌在培养基及土壤中对莠去津的降解效果。结果表明，通过筛选获得 2 株( N1 和 N34) 对莠去津具有降解作用的细菌，Biolog 微生物自动鉴定仪鉴定 N1 和 N34 分别为腐叶芽孢杆菌 ( Bacillus decisifrondis) 、弗雷尼棒状杆菌( Corynebacterium freneyi) 。在 LB 液体培养基中，2 株细菌对莠去津都具有降解作用， 96 h 时绝对降解率分别为 62. 34% 、90. 39% ; 在土壤中 N34 对莠去津的降解率无论在灭菌土壤还是未灭菌土壤中的绝对降解率都能达到 60% 以上。菌株 N34 中莠去津降解酶不是分泌型的，说明其主要是通过菌体生长利用代谢来降解莠去津的。

　　关键词: 莠去津; 降解菌; 降解酶; 降解效果; 腐叶芽孢杆菌; 弗雷尼棒状杆菌

　　近年来，除草剂大量和高剂量使用对环境和下茬作物的影响越来越受到人们的关注[1 - 3]。抑制光系统Ⅱ的除草剂莠去津在世界范围内被广泛用来控制玉米和高粱田阔叶及 1 年生杂草，已经应用长达几十年[4 - 8]。莠去津一般被认为是不易矿化降解的化合物，其在土壤中的半衰期较长( 1 ～ 12 个月) 。莠去津因其在土壤中流动性大，容易在地下水中检测到，一般认为莠去津是土壤或地下水的污染物[9 - 10]。莠去津虽然在控制农田杂草中发挥了非常大的作用，但已有研究表明莠去津对土壤微生物、水生生物甚至人类健康都有影响[11 - 14]。目前，土壤和水中有机污染物的清除一般可采用物理化学方法，比如换土、活性炭吸附、热解析、土壤氧化、焚烧等方法，也可以采用具有降解有机污染物的微生物进行生物修复[15]。土壤微生物在化学农药的降解和转化中起着非常重要的作用，微生物可将持久性农药作为能源或营养来利用，也可通过和其他物质共代谢来利用[16]。目前，已经发现诺卡氏菌属( Nocardia) 、土壤杆菌属( Agrobacterium) 、芽孢杆菌属 ( Bacillus) 、假单胞菌属( Pseudomonas) 等 19 个属的细菌具有降解土壤莠去津的能力[17 - 20]。这些菌株含有 1 种或几种不同的降解基因( 如 atzA、atzB、atzC、atzD、atzE、atzF、atzC - trzD、 trzN - atzB 等) ，能将莠去津完全或部分降解[21 - 25]，从而消除莠去津的毒性。但关于莠去津降解酶具体定位( 胞内或胞外) 的研究还鲜有报道。因此，本研究利用笔者所在实验室保存的各种细菌，分离和筛选具有降解莠去津能力的细菌，并分析这些细菌在培养基和土壤中对莠去津的降解效果，验证获得细菌的莠去津降解酶类的定位，以期为解决土壤中残留莠去津的降解奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1. 1 供试材料

　　菌株: 试验所用 40 株菌株来自沈阳农业大学植物保护学院免疫研究所保存的细菌( 是土壤或植物内生细菌) 。

　　溶菌肉汤( lysogeny broth，简 称 LB) 培 养 基: 胰 蛋 白 胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，琼脂 18 g，蒸馏水 1 000 mL， pH 值为 7. 4 ～ 7. 6，于 121 ℃ 灭菌 30 min，备用。牛肉膏蛋白胨培养基: 牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，琼脂 18 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 值为 7. 0 ～ 7. 2，于 121 ℃ 灭菌 30 min，备用。基础无机盐培养基: KH2PO4 0. 45 g，K2HPO4 1. 79 g，Mg2 SO4 0. 10 g，NaCl 0. 40 g，琼脂 18. 00 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 值为 7. 5，于 121 ℃ 灭菌 30 min，备用。Biolog 通用生长( Biolog univcrsal growth，简称 BUG) 培养基: BUG 琼脂培养基 57. 0 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 值为 7. 3 ± 0. 1，于 121 ℃ 灭菌 15 min，备用。

　　除草剂: 莠去津原药，有效成分大于 97% ，购自山东淄博新天地农业机械有限公司。

　　1. 2 试验方法

　　1. 2. 1 莠去津降解菌株的筛选及鉴定

　　1. 2. 1. 1 含药培养基配制 准确称取 1 g 莠去津原药，加入 10 mL 无菌水，配制成莠去津母液，在 99 ℃ 恒温水浴锅中水浴加热，边水浴边不停搅拌，并滴入适量吐温 - 80，至药品粉末完全溶解。取 900 μL 莠去津母液加入到 150 mL 培养基中，摇匀，制成莠去津含量为 600 μg / L 的培养基。

　　1. 2. 1. 2 耐药性和可利用莠去津菌株的筛选 用 LB 培养基将待筛菌株活化培养 2 代，挑取活化后的菌株用无菌水稀释菌液，使其 D600 nm = 1。将 LB 培养基制成平板，取 200 μL 菌液均匀地涂在平板上。以不含除草剂的 LB 培养基平板为对照，于 30 ℃培养 2 d 后观察细菌的菌落生长情况。每组 3 次重复。在 LB 培养基初筛基础上，在只含有莠去津为碳源的基础无机盐培养基上进行进一步筛选，取 200 μL 菌 液 ( D600 nm = 1) 均匀地涂在以莠去津为碳源的基础无机盐培养基平板上，培养 2 d 后调查细菌菌落数。以常规的基础无机盐培养基( 不含莠去津) 为空白对照。每组 3 次重复。

　　1. 2. 1. 3 细菌菌种鉴定 将筛选获得的能利用莠去津为唯一碳源的菌株进行革兰氏染色，鉴定该细菌是阴性菌还是阳性菌。将菌株用 BUG 培养基培养 24 h，用棉签蘸取微量纯培养菌，接入细菌鉴定用革兰氏阴性/阳性接种液( GN /GP - IF) 中，混匀。用浊度计测浑浊度，当透光率达到 98% 时为最适。将接菌后的接种液倒入加样槽，用八排道移液器快速接入 Gen Ⅲ鉴定板中，于 30 ℃恒温培养 16 ～ 24 h 后，进行微平板读数，分析鉴定结果。

　　1. 2. 2 菌株 N1 和 N34 对莠去津降解效果

　　1. 2. 2. 1 实验室液体培养条件下的降解效果

　　取 20 mL 菌液( D600 nm = 1) 接入 150 mL 含药( 600 μg / L) 的 LB 液体培养基中，置于 28 ℃、120 r /min 的摇床上连续培养 7 d，分别于 12、24、48、72、96、120、144 h 取样。设 3 次平行试验。

　　取 5 mL 培养液于 25 mL 具塞试管中，加入等体积的乙酸乙酯，在翻转摇匀仪上充分振荡提取 10 min，静置分层，取乙酸乙酯上层，收集的乙酸乙酯用旋转蒸发仪于 42 ℃ 浓缩近干，用色谱级甲醇定容至 1 mL，过 0. 2 μm 有机滤膜。

　　将分离纯化的提取液于岛津高效液相色谱仪中进行测定，莠 去 津 液 相 色 谱 分 析 条 件: 色 谱 柱 为 Agilent Zorbax SB - C18 色谱柱( 250 mm × 4. 6 mm × 5 μm) ，柱温为 30 ℃，波长为 222 nm，流动相为甲醇 ∶ 水 = 70 ∶ 30( 体积比) ; 流速为 0. 8 mL/min; 进样量为 10 μL。然后根据下面的公式计算土壤样本中莠去津的含量:

　　式中: R 为样本中莠去津残留浓度，mg / L; S样 为样本峰面积， mV·min; C标 为标准溶液浓度，mg / L; V样 为样本定容体积， mL; S标 为标准溶液峰面积，mV·min; W 为采样量，L。

　　莠去津降解率的计算公式:

　　莠去津降解率 = 1 - 实测莠去津含量/莠去津添加量 × 100% ;

　　莠去津绝对降解率 = ( Vt - VCK ) /( 1 - VCK ) × 100% 。

　　式中: Vt 为接菌处理培养基中莠去津的降解率; VCK为未接菌处理培养基中莠去津的降解率。

　　1. 2. 2. 2 实验室土壤中的降解效果 取沈阳农业大学连续 3 年没有施过除草剂的表层 10 cm 土壤，在室内通风处自然风干后，过 100 目筛。将土壤分装成 100 g /瓶，并保持土壤湿度在 60% 左右。分装后的土壤分为 2 组，一组瓶装土壤于 121 ℃、30 min 灭菌 2 次，另一组不灭菌。分别设不添加除草剂的对照处理和莠去津处理( 终浓度为 2 000 μg / kg) 。将纯化后的菌株用 LB 培养基活化 2 代，并稀释为菌悬液，使其 D600 nm = 1，每瓶土壤接入 20 mL 菌悬液，每个处理 3 次重复。于室温条件下培养，分别在 1、3、5、7、14、21、28、35、42、49 d 取样，用于莠去津残留量检测。

　　超声提取: 准确称取 10 g 土壤样品于 50 mL 具塞离心管中，加入 20 mL 提取液混匀后，用超声波清洗器超声提取 30 min，再 振 荡 提 取 30 min 后，加 入 5 g 氯 化 钠，于 5 000 r /min 离心 5 min，取 10 mL 上清液于 50 mL 离心管中，在 50 ℃ 水浴锅中减压旋转蒸干，加入 2 mL 甲醇溶解，待净化。

　　净化: 将 5 mL 甲醇移入石墨炭 GCB 小柱( 小柱活化) 后，移入 2 mL 样品，再移入 10 mL 甲醇收集，50 ℃水浴旋转蒸干后，加入 1 mL 甲醇定容，过 0. 22 μm 有机相针式滤器于进样小瓶中待测。液相检测和降解率计算方法同“1. 2. 2. 1”节。

　　1. 2. 3 细菌菌株 N34 中莠去津降解酶的定位

　　1. 2. 3. 1 胞内( 外) 粗酶液提取 将菌株 N34 接种于含有 1 000 mg / L 莠去津的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于 180 r /min、30 ℃恒温摇床培养 48 h，取培养液于 5 000 r /min 离心 15 min，取上清液并收集菌体。向上清液中加入硫酸铵，边加入边不停搅拌至硫酸铵饱和度达 100% ，盐析过夜。于 4 ℃、10 000 r /min 离心 30 min，收集沉淀，将沉淀溶于 pH 值为 7. 0 的 0. 05 mol / L Na2HPO4 - NaH2PO4 缓冲液中透析至无硫酸根，得到胞外粗酶液。细菌菌体用 20 mL pH 值为 7. 0 的 0. 05 mol / L Na2HPO4 - NaH2PO4 缓冲液洗涤 2 ～ 3 次。取菌体，加入 3 倍体积的缓冲液将菌体悬于缓冲液中。将菌悬液置于冰浴中用超声波细胞破碎仪进行破碎处理，超声波破碎 5 s，停 5 s，共 25 个循环。于 4 ℃、10 000 r /min 离心 30 min，取上清液，得到胞内粗酶液。

　　1. 2. 3. 2 胞内( 外) 降解酶对莠去津降解效果的测定 为了确定莠去津降解酶是属于胞内酶还是胞外酶，取 2. 8 mL 含 50 μg / L 莠 去 津、pH 值 为 7. 0 的 0. 05 mol / L Na2HPO4 - NaH2PO4 缓冲液，在 30 ℃ 预热，再加入 200 μL 预热的胞内 ( 外) 粗酶液，使酶反应体系的总体积为 3. 0 mL; 30 ℃ 水浴保温 2 h，加入 0. 2 mL 1 mol / L 盐酸中止酶反应。每个处理 3 次重复，同时设不加酶液的处理为空白对照。然后用 9 mL 甲醇分 3 次萃取反应液中剩余的莠去津，最后定容到 10 mL，于 50 ℃ 水浴中旋转蒸干，取 1 mL 甲醇定容，过 0. 22 μm 滤膜，用液相色谱测定莠去津的含量，并计算降解率。

　　1. 2. 4 数据分析方法 将所得数据通过 Excel 和 SPSS 10. 0 进行统计分析。

　　2 结果与分析

　　2. 1 莠去津降解菌株的筛选及鉴定

　　将细菌稀释液涂布到含有莠去津的 LB 培养基上过夜培养后，发现菌株 N1 和 N34 可以在含莠去津的培养基上生长 ( 图 1) ，而其他 38 株细菌均不能在含莠去津的培养基上生长。进一步在含有莠去津而未加其他碳水化合物的基础培养基上进行培养，发现在以莠去津为碳源的情况下，这 2 株细菌都可以正常生长，细菌菌株 N1 和 N34 的菌落数分别为 254、 462 个( 图 2) ，由此可以看出这 2 株细菌都能降解或利用莠去津。

　　经革兰氏染色发现，菌株 N1 和 N34 均呈阳性反应，均为革兰氏阳性菌。利用 Biolog 微生物自动鉴定仪对 2 株菌株进行菌种鉴定，结果如表 1 所示，鉴定得出菌株 N1 为腐叶芽孢杆菌( Bacillus decisifrondis) ，菌株 N34 为弗雷尼棒状杆菌 ( Corynebacterium freneyi) 。

　　2. 2 菌株 N1 和 N34 对莠去津的降解效果

　　在农药残留分析中，常用添加回收率和相对标准差来衡量准确度和精密度。本试验分别分析了莠去津在无机盐培养基和土壤中的回收率。按照建立的样本提取方法和色谱条件对样本进行测定，并用相近浓度的基质标准溶液单点校正。由表 2 可 知，莠去津在无机盐培养基中的平均回收率为 83. 54% ～ 95. 31% ，相对标准差为 1. 23% ～ 5. 98% ; 莠去津在土壤中的平均回收率为 90. 23% ～ 113. 29% ，相对标准差为 3. 32% ～ 4. 81% ，符合农药残留分析要求。

　　由表 3 可知，在无机盐培养基中莠去津自然降解率在 144 h 只有 27. 58% ，加入莠去津降解菌后，降解率明显提高。菌株 N1 对莠去津的降解率在 12 ～ 72 h 持续上升，在 72 h 时绝对降解率达 55. 34% ，之后上升幅度变小，在 96 h 后绝对降解率维持在 62% 左右。菌株 N34 对莠去津的降解率在 48 ～ 96 h 上升幅度较大，在 96 h 时绝对降解率达 90. 39% ，之后降解率变化幅度较小，由此可以看出菌株 N34 对莠去津的降解作用明显优于菌株 N1。

　　在无机盐培养基中菌株 N34 对莠去津的降解效果明显好于菌株 N1，因此检测菌株 N34 在土壤中对莠去津的降解作用。由表 4、表 5 可知，无论在灭菌土壤还是未灭菌土壤中，除草剂莠去津的自然降解速度均较快，但加入菌株 N34 后降解速度更快。在灭菌土壤中菌株 N34 对莠去津的降解率在 28 d 时 就 达 到 了 90% 左 右，绝 对 降 解 率 在 49 d 时 为 62. 33% ; 在未灭菌土壤中，在 21 d 时菌株 N34 对莠去津的降解率就达到了 90% 以上，绝对降解率最高，为 62. 80% 。由此可以看出菌株 N34 对除草剂莠去津具有明显的降解作用，可以用作田间土壤中莠去津的清除。同时研究发现，未灭菌土壤中莠去津的自然降解率基本均高于灭菌土壤中莠去津的自然降解率，说明土壤中存在的微生物对莠去津也有降解作用。

　　2. 3 莠去津降解酶定位

　　由表 6 可知，胞外粗酶液对莠去津的降解率与对照相似，说明细菌 N34 菌株不分泌莠去津降解酶于培养液中; 而胞内粗酶液对莠去津有明显的降解活性，降解率达到 99. 00% 。由此可见，菌株 N34 产生的降解酶主要位于细胞内，说明细菌 N34 应该是通过生长利用代谢来降解莠去津的。

　　3 结论与讨论

　　微生物对除草剂的反应是多种多样的，现有研究表明，除草剂对土壤微生物有刺激生长和抑制生长的作用[26 - 28]，说明不同微生物对除草剂具有不同的响应机制。本研究也发现，不同细菌菌株对莠去津的响应不同，有的菌株对莠去津非常敏感，在含莠去津的培养基上不能生长，有的菌株能够生长，但不能利用莠去津，达不到降解莠去津的效果。本研究从 40 株细菌中筛选出 2 株莠去津降解菌，分别为菌株 N1 和 N34，而且 2 株菌株的降解能力也有一定差距，因此除草剂降解菌的筛选最好能够在含有除草剂为唯一氮源或碳源的培养基上进行，提高获得降解菌的效率。另外，微生物降解除草剂主要通过 2 种机制来进行，一是通过生长代谢，微生物直接利用除草剂为氮源或碳源来降解; 另一种是通过共代谢作用，微生物需要其他碳氮源来生长，通过改变难降解除草剂的化学结构来分解，而且往往须要诱导作用才能发挥作用[29 - 31]。本研究发现，菌株 N34 并不是通过分泌降解酶来降解莠去津，而是通过生长代谢来达到目的。

　　灭菌土壤中莠去津的降解效果不如未灭菌土壤，这可能与土壤中的微生物有关[32]。很多研究表明，微生物在莠去津残留土壤修复中起着重要的作用[33]，本研究中筛选得到的菌株 N34 在培养基和土壤中对莠去津的绝对降解率都达到了 60% 以上，说明该菌株可以用来修复莠去津残留土壤。另外，微生物修复除草剂污染土壤过程中还受到土壤中有机质和其他营养成分的影响[34]，因此提高菌株 N34 对莠去津的降解效果还须要进一步进行相关研究，以提高菌株 N34 对莠去津的降解作用。

　　除草剂莠去津降解菌的筛选及降解效果相关期刊推荐：《江苏农业科学》(月刊)创刊于1973年，是由江苏省农业科学院主管并主办的综合性农业科技期刊。共设有：专论、作物栽培与育种、农业产业化、植物保护、园艺、畜牧兽医、特种种养、水产养殖、农产品贮藏与加工等栏目。有投稿需求的作者，可以咨询在线编辑。