齐齐哈尔地区仔猪腹泻大肠杆菌血清型与毒力基因分析

发布时间：2019-12-30

　　摘要：为了解黑龙江省齐齐哈尔地区仔猪腹泻大肠杆菌的优势血清型和毒力基因流行情况，从齐齐哈尔地区40个养猪场的腹泻仔猪体内分离到100株致病性大肠杆菌，通过凝集试验和分子生物学检测方法进行血清型及毒力基因检测。血清型检测结果表明，100株大肠杆菌有49个分离株鉴定出血清型，其中O8、O9、O101、O147、O157、O64为优势血清型，占定型菌株的77.55%。毒力基因PCR测定结果表明，黏附素基因987P(50/71，70.42%)、肠毒素基因LT(65/71，91.54%)、强毒力岛FyuA(43/71，60.56%)为主要流行的毒力基因。研究揭示了齐齐哈尔地区仔猪腹泻大肠杆菌的优势血清型和主要携带的毒力基因，为临床防治大肠杆菌性仔猪腹泻提供了科学依据。

　　关键词：齐齐哈尔地区;猪;致病性大肠杆菌;血清型;毒力基因

　　仔猪腹泻是由致病性大肠杆菌引起的猪肠道传染病，常呈腹泻、生长缓慢、脱水和酸中毒等现象，严重可导致死亡[1]。当前，集约化饲养方式、断奶日龄的提前、抗菌药物滥用和产房管理等诸多因素均加剧了该病的严重性。据报道，仔猪腹泻病发病率和死亡率分别高达57%和10.8%，给养殖业造成了极大的经济损失[2]。此外，大肠杆菌血清型众多、毒力基因和耐药基因复杂，也为临床防治大肠杆菌造成了诸多困难。引起该病的大部分毒力因子主要有菌毛和肠毒素(STa和/或sTb)[3]，血清型往往带有K88、F18等，且各具独特的抗原性[4-8]。国外报道的血清型主要有O149、O139、O141、O147、O8、O138和O157等。不同地区仔猪源大肠杆菌的血清型不尽相同，优势的血清型经过一段时间后，会有新的优势血清型出现，不同时期流行的血清型也不尽相同。因此，研究拟调查齐齐哈尔地区仔猪腹泻大肠杆菌血清型、毒力基因的分布和流行情况，为该地区临床防治仔猪腹泻提供科学依据。

　　1材料与方法

　　1.1样品来源

　　无菌采取腹泻仔猪的肠道内容物及十二指肠和肠系膜淋巴结，冷藏并迅速送往所在细菌实验室，进行大肠杆菌的常规分离鉴定。

　　1.2主要试剂与培养基

　　EMB、MAC等选择培养基均购自北京奥博星生物技术有限公司;DNA提取试剂盒、Marker均购自TaKaRa试剂公司;大肠埃希氏菌“O”抗原血清购自中国兽药监察所;大肠杆菌毒力基因引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成;生化管购自杭州天和微生物试剂有限公司，批号为：160217。

　　1.3细菌分离鉴定

　　用无菌接菌环沾取少量病料划线接种于鉴别培养基中，37℃恒温培养18～24h，观察平板中菌落形态与颜色变化初步鉴定。挑取单一菌落接种于普通培养基中37℃恒温培养18～24h，冻干保存备用[9]。

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　　1.4染色镜检与生化鉴定

　　将冻干保存的菌种复苏，挑取纯化后的营养琼脂中的单菌落进行染色镜检。结合镜下大肠杆菌的形态与平板中的菌落特征进行鉴定，判定结果与大肠杆菌相符合的菌种进行生理生化试验，做进一步鉴定。

　　1.5致病性大肠杆菌O血清型鉴定

　　1.5.1玻板凝集试验

　　参照兽药监察所大肠埃希氏菌“O”抗原定型血清使用说明书。首先将大肠杆菌培养液高压处理2h(121℃)。而后吸取1mL置于离心管中，16099.2xg离心10min后弃掉上清，用0.5%的石炭酸生理盐水重悬沉淀，制成菌悬液。待冷却后，在玻板上与少量的大肠杆菌多因子血清混匀，若在0.5min内出现明显的凝集现象，判定为阳性反应，阴性对照选择菌悬液与生理盐水混合物。以同样的方法采用单因子血清测定大肠杆菌血清型。

　　1.5.2试管凝集试验

　　参照兽药监察所大肠埃希氏菌“O”抗原定型血清使用说明书，首先吸取50μL的待检菌液，接种于装有5mL的液体培养基中，经过37℃恒温摇床培养18～24h后，高压处理2h(121℃)，待其荚膜抗原被破坏后，配置成109CFU·mL-1的菌液，与不同梯度的单因子血清做试管凝集反应。每个试管加入稀释后的血清0.5mL，并加入等体积的被检抗原，震荡混匀。将抗原加石炭酸生理盐水作为抗原对照，记录每个试管的反应情况。

　　1.6致病性大肠杆菌基因组DNA的提取取

　　1.5mL的LB菌液于5mL的离心管中，18894.2xg离心30s，弃掉上清液，收集沉淀，0.5mLTE缓冲液或PBS悬浮沉淀，按试剂盒方法提取基因组DNA，-20℃冰箱中保存备用。

　　1.7引物设计

　　根据已有的文献报道，对毒力基因irp2、fyuA、elt、STa、STb、LT、astA、Stx2e、STI、K88、F4I、K99、987P的引物进行合成。引物序列详见表1，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

　　1.8PCR检测

　　按照25μLPCR反应体系，对毒力基因进行PCR扩增检测，以菌株染色体DNA为PCR扩增的模板。反应条件：TaqMasterMix，(2×)12.5μL;ForwardPrimer(10μM)1.0μL;ReversePrimer(10μM)1.0μL;Tem-plate0.5μL;ddH2O10.0μL;Totalvolume25.0μL。

　　1.9琼脂糖凝胶电泳

　　PCR扩增后，吸取适量PCR扩增产物，选择DL2000Marker进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯观察电泳结果并用凝胶成像系统拍照。

　　2结果

　　2.1细菌分离结果

　　在固体培养基中生成灰白色半透明菌落、表面光滑;在选择培养基(MAC)中生成红色透明菌落、在EMB中生成黑色金属光泽菌落;液体培养基(NB)中恒温培养18～24h后产生絮状沉淀。

　　2.2染色镜检与生化鉴定

　　经染色镜检后判定为G-杆菌，镜下呈两端钝圆中间稍细的短小杆菌、不形成芽孢，个别成球杆状;经生化试验鉴定，对葡萄糖、麦芽糖、乳糖均可发酵;对靛基质、甲基红、MR试验均显示阳性;对VP、枸橼酸盐试验均为阴性，结果通过《伯杰氏细菌鉴定手册》进行鉴定，被检样品均符合大肠杆菌的生化反应特性。

　　2.3致病性大肠杆菌O血清型鉴定结果

　　通过玻板凝集与试管凝集试验鉴定，结果在100个分离株中共鉴定出49个分离株的血清型，共覆盖了12个血清型，主要血清型6种分别为：O8、O9、O101、O147、O157、O64，它们拥有38个分离株，占定型菌株的77.55%，为这次致病性大肠杆菌调查的主要流行血清型，详见表2。

　　2.4毒力基因PCR检测结果

　　对100株致病性大肠杆菌毒力基因(irp2，FyuA，elt，STa，STb，LT，astA，stx2e，STI，K99，K88-2，F41-2，987P)进行PCR检测，共有71株大肠杆菌检测到毒素基因，见表2，其中拥有LT基因的菌株有65株(91.54%)，987P基因的菌株有50株(70.42%)，FyuA基因菌株有43株(60.56%)，为主要流行的毒力基因，见图1-3。

　　3讨论

　　在血清型方面，国内仔猪腹泻大肠杆菌主要以O149、O107、O93和O98等血清型为主。其中黑龙江地区2004年分离的仔猪黄痢病料，菌株血清型鉴定为O8、O9、O60、O64、O115、O149、O157，分离的仔猪白痢病料血清型分别为O8、O9、O139、O157。而研究结果表明，齐齐哈尔地区优势血清型为O8、O9、O101、O147、O157、O64，未检测到O149，反而新增加了O101和O147，且该血清型国内外均少见。由此可见，在国内不同地区，优势血清型不同。而同一地区，不同时期的优势血清型也不完全一致。在国外，优势血清型为O149、O8、O147及O157，同时，越来越多的O9、O64和O101血清型菌株被分离得到。由此可见，近年来国内外的仔猪腹泻大肠杆菌血清型逐渐呈多元化分布，新的血清型逐渐增多。

　　在毒力因子方面，国内的毒力因子主要有菌毛和肠毒素(STa和/或sTb)，其中K88+和F18+菌株较为常见，K99+和987P+菌株则很少见。王红宝等[10]对山西省猪大肠杆菌进行了毒力基因检测，结果黏附素基因987P(8/97，8.2%)，肠毒素基因LT(34/97，35.1%)，强毒力岛FyuA(13/97，13.4%)为主要流行毒力基因。陈祥等[11]对江苏省部分地区大肠杆菌毒力基因检测，FyuA基因扩增阳性，2.1%(21/1007)。佟春玉等[12]对黑龙江地区大肠杆菌毒力基因分析，肠毒素检出菌株74株，占分离株的60.16%，其中以STa和STb为主，共占检出株的94.59%。国外主要肠毒素为LT、STb、STa，一些菌株具有K99、987P及F41。在瑞士，引起仔猪腹泻的大肠杆菌主要为O139：K12：H1(F18ab，Stx-2e)、O141：H4(F18ab，Stx-2e，LT，STb)和O149：K91：H10(K88ac，LT，STb)[13];国内外检测结果表明，毒力基因主要以LT、STa和STb为主，部分检出FyuA和987P。研究检出的引起仔猪腹泻大肠杆菌主要为O147(LT，5/65)毒力基因阳性检出率为91.54%、O101(987P，8/50)毒力基因阳性检出率为70.42%、O8(FyuA，7/43)毒力基因阳性检出率为60.56%，均未检测出F41-2，部分菌株检测出STa和STb。值得注意的是FyuA和987P检出率高于国内外的检出率。

　　猪大肠杆菌血清型众多，大肠杆菌病长期以来一直制约着我国养猪业的发展，造成了巨大的经济损失[14-18]。研究结果表明，黑龙江省齐齐哈尔地区仔猪腹泻大肠杆菌的主要毒力基因为黏附素、肠毒素和强毒力岛，优势血清型为O8、O9、O101、O147、O157、O64。研究为临床防治大肠杆菌性仔猪腹泻提供了科学依据。