鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定

发布时间：2019-12-13

　　摘要为对某鸡场发生的呼吸道疫病进行确诊，并对致病原进行分离和鉴定，本研究进行了发病鸡场临床诊断、病毒分离、分离毒株血凝试验、分离毒株RT-PCR检测以及序列分析等系列试验。试验结果显示，该病的临床特征疑似鸡传染性支气管炎病毒感染，临床病料样品接种鸡胚后可引起鸡胚死亡以及“侏儒胚”等典型症状，分离毒株无血凝性，分离毒株经传染性支气管炎病毒特异性引物检测为阳性，且序列分析显示RT-PCR扩增产物为鸡传染性支气管炎病毒特异性核苷酸序列，表明引起鸡场此次疫病的致病原为鸡传染性支气管炎病毒。

　　关键词鸡;传染性支气管炎病毒;分离;鉴定

　　鸡传染性支气管炎(Infectiousbronchitis，IB)是一种急性和接触性鸡群传染病，其致病原为鸡传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitisvirus，IBV)，该病对鸡的传染性和致病性均很强，肉鸡感染后可导致生长缓慢以及饲料利用率下降，蛋鸡感染后可导致产蛋量和蛋品质下降，是危害我国养鸡业的主要传染病之一[1-2]。2018年10月，山东省宁津县某蛋鸡养殖场发生了1例以呼吸障碍为主要特征的呼吸道传染病，为对疫病进行确诊，本实验室利用10日龄SPF鸡胚成功分离到了1株鸡传染性支气管炎病毒，现将整个试验过程汇报如下。

　　1材料与方法

　　1.1SPF鸡胚

　　10日龄SPF鸡胚购自济南斯帕法斯家禽有限公司。

　　1.2临床诊断

　　调查鸡场的发病情况，观察临床症状，对病死鸡解剖，观察病理变化。

　　1.3病料样品的采集

　　无菌采集病死鸡的气管、支气管等病变组织进行实验室诊断。

　　1.4鸡胚接种与病变观察

　　将采集的临床病料按1∶3加入灭菌生理盐水，用研磨器研磨成组织匀浆，离心机12000r/min离心5min，取上清液用0.45μm的滤器过滤除菌，接种10日龄SPF鸡胚10个，接种后24h照胚，死亡的鸡胚弃去，然后每天照鸡胚2次，死胚放置4℃保存，待鸡胚全部死亡后无菌收集尿囊液，-80℃保存备用，同时观察死亡鸡胚的病变特征。

　　1.5分离毒株的血凝试验

　　按照常规血凝试验方法测定分离毒株对1%鸡红细胞的血凝性。

　　1.6分离毒株的RT-PCR检测

　　根据参考文献[3]对分离毒株进行一步法RTPCR检测，一步RT-PCR反应体系为：2×oneStepBuffer25μL、PrimeScript1StepEnzymeMix1μL、上下游引物P1、P2(20μmol/μL)各1μL、RNA10μL，加水至50μL。PCR反应条件为：50℃45min;94℃5min;94℃30s，55℃30s，72℃45s，30个循环;72℃10min;4℃终止反应，RT-PCR扩增产物经琼脂糖电泳观察。

　　1.7分离毒株的序列分析

　　将分离毒株的RT-PCR扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定，将测序获得的核苷酸序列与GenBank中登录的核苷酸序列进行比对分析。

　　2结果与分析

　　2.1临床诊断结果

　　该场共饲养蛋鸡10000只，2018年10月开始出现发病和死亡病例，蛋鸡的产蛋率下降，蛋品质也下降，发病鸡有300只左右，有60只鸡死亡。发病鸡主要表现为咳嗽，呼吸困难，气管有呼噜音，打喷嚏，病鸡精神沉郁，食欲下降，产蛋下降，产软壳蛋和畸形蛋，发病1周左右死亡。对病死鸡剖检可见主要病变部位在气管和支气管，气管和支气管有出血，有渗出液，蛋鸡卵泡充血、出血，鼻腔和鼻窦有浆液性渗出物。综合发病情况、临床症状和病理变化，该病例疑似鸡传染性支气管炎病毒感染。

　　2.2鸡胚接种与病变观察结果

　　临床病料样品接种的10日龄SPF鸡胚在接种24~48h内鸡胚全部死亡，剖检死亡鸡胚可见胚体蜷缩、矮小，具有“侏儒胚”的典型症状。收集死亡鸡胚尿囊液作为分离毒株。

　　2.3分离毒株的血凝试验结果

　　分离毒株对1%鸡红细胞无血凝性。

　　2.4分离毒株的PCR检测结果

　　如图1所示，分离毒株的RT-PCR扩增产物经琼脂糖电泳可见459bp的特异性条带，大小与预期大小一致。

　　2.5分离毒株的序列分析结果

　　分离毒株的RT-PCR扩增产物测序后，核苷酸序列比对分析显示，其为鸡传染性支气管炎病毒特异性核苷酸序列，证实分离毒株为鸡传染性支气管炎病毒。

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　　3讨论

　　鸡传染性支气管炎的诊断主要通过临床症状、病理变化等进行初步诊断，确诊需要借助实验室检测技术。病毒分离是鸡传染性支气管炎最经典、准确的实验室诊断方法，且本研究在病毒分离的基础上借助RT-PCR扩增和序列分析对分离毒株进行鉴定，从分子水平证实分离毒株为鸡传染性支气管炎病毒，表明引起鸡场此次疫病的致病原为鸡传染性支气管炎病毒，临床中应加强对该病的诊断和防控。由于鸡传染性支气管炎病毒为病毒病，感染后没有特效治疗药物，本病主要是预防为主，养殖场主要通过加强疫苗的免疫接种来预防本病，本病的疫苗主要是弱毒苗和灭活苗，包括H120和H52两个毒株，H120的毒力弱，适用于雏鸡免疫;H52的毒力强，主要用于20日龄以上鸡免疫，灭活苗相对安全，可以用于各种日龄鸡免疫，一般是5~7日龄用H120首免，25~30日龄用H52进行二免。鸡场预防本病要做好定期消毒，保持通风换气，注意鸡舍的温度和湿度，平时搞好饲养场卫生，增加饲料中多维素的用量，发病后及时补充钠和钾，应用抗生素治疗，防止继发感染。