基于血小板及其膜的仿生递药系统研究进展
发布时间：2019-12-12
摘要 血小板是人体血液中重要的固有成分，在机体各类生理反应中发挥重要作用。近年来，基于血小板及其膜的仿生新型药物传递系统备受关注。与传统药物载体相比，血小板及其膜仿生递药系统具有生物相容性好、血液循环时间长和体内靶向性强等优势。本文介绍了基于血小板及其膜仿生递药系统的特点、种类、载药方式及应用，以期促进血小板及其膜仿生载体在药物递送领域的研究与应用。
关键词 血小板;血小板膜;药物载体;生物仿生;纳米;递药系统
目前，在纳米递药系统研究中，存在着诸如生物相容性差、血液循环寿命短、主动靶向性不足、生物膜屏障透过率不高等问题。尤其在血液循环中，会吸附大量非特异性蛋白质和生物分子在其表面形成蛋白质干扰层[1-2]，极大地影响了纳米载体按照设计预期到达病灶部位并发挥应有的疗效。因此，基于机体循环系统中各种细胞仿生的新型递药系统应运而生，逐渐成为近年来生命科学领域的研究热点[3-4]。其中，血小板及其膜仿生递药系统(plateletandplateletmembranebiomimeticdrugdeliverysystem)引起了研究者们极大的关注。血小板作为生物体内的固有成分，可以逃避免疫系统清除，且和血管内皮损伤修复[5-6]、免疫应答[7-8]、动脉粥样硬化形成[9]、神经退行性变[10]、肿瘤生长转移[11]等生理过程密不可分。血小板在参与这些机体反应的过程中，能很好地靶向富集到反应部位。所以，血小板及其膜仿生递药系统在肿瘤靶向、病原微生物吸附、血管内皮损伤修复以及凝血等领域展现出巨大的应用前景。本文综述了基于血小板及其膜仿生递药系统的研究现状与应用，以期促进血小板及其膜仿生载体在药物递送领域的研究与开发。
1血小板的性质和特点
血小板是由成熟巨核细胞分化出的无核细胞，平均粒径在2～5μm，是血液中体积最小的成分，其平均生命周期为7～10d。随着对血小板研究的深入，人们发现血小板在许多生理和病理过程中起到至关重要的作用，如参与血管内皮损伤的修复过程:凝血和止血，维持血管完整性和诱导血栓形成等[5]。此外，还与组织修复[6]、免疫应答[7-8]、动脉粥样硬化形成[9]、神经退行性变[10]以及肿瘤生长和转移[11]等密切相关。
在血小板膜表面，富含多种特异性膜蛋白，如免疫调节蛋白CD47、CD55、CD59;整合素αⅡb、α2、α5、α6、β1、β3;穿膜蛋白GPIbα、GPIV、GPV、GPVI、GPIX、GLEC-2等。这些膜蛋白为血小板发挥特定生理作用提供了强有力的支持。例如在血管损伤时，血小板表面GPIb-IX-V受体上的GPIbα糖蛋白，损伤内皮细胞分泌的血管性血友病因子(vWF)相结合，同时血小板表面的GPIa-IIa和GPVI糖蛋白结合到损伤部位的内皮下胶原蛋白，激活血小板及许多信号通路，使大量血小板聚集黏附于损伤血管处，形成纤维蛋白堵塞损伤部位[12]。
2血小板及其膜仿生递药系统的种类
根据载药方式与组装方法，血小板及其膜仿生递药系统可以分为3类:(1)药物共价偶联在血小板膜上的载体;(2)药物直接包载于血小板内的载体;(3)血小板膜包覆的纳米载体。
2.1药物共价偶联在血小板膜上的载体
药物共价偶联在血小板膜上的载体，是以天然血小板为媒介，通过化学共价结合或生物工程手段将药物偶联或表达于血小板膜上的递送载体(图1)。其利用血小板在肿瘤组织、循环肿瘤细胞(CTC)、损伤血管等部位的靶向结合能力，将药物递送至病灶，随后血小板激活，释放含药微粒起到治疗作用。
Wang等[13]将程序化死亡配体1(PDL1)抑制剂修饰于未激活状态的活体血小板上，用于肿瘤术后复发的免疫治疗研究。Li等[14]通过基因工程手段在血小板表面表达诱导肿瘤凋亡的坏死因子，通过自体血小板与迁移肿瘤细胞的作用关系为靶向机制来抑制肿瘤细胞的转移。
2.2药物直接包载于血小板内的载体
药物直接包载于血小板内的载体，是通过化学法、电穿孔法、胞吞法、低渗法和脂质融合法等手段[15]，将药物包载于天然血小板内的递送载体(图2)。利用天然血小板的保护，可以提高药物的稳定性，减少不良反应，增强治疗效果。
Xu等[15]首次利用血小板上开放的微管系统，将阿霉素(DOX)物理包载于血小板内，利用血小板对肿瘤部位的靶向结合特性，靶向治疗淋巴瘤。应用该递药载体对荷瘤小鼠给药治疗10d后，与游离DOX相比，肿瘤体积缩小至原来的二分之一。
2.3血小板膜包覆的纳米载体
血小板膜包覆的纳米载体，是通过静电吸附作用将血小板膜包覆于纳米载体表面，亦可对其膜表面进一步修饰的功能性递送载体(图3)。
从新鲜血液中提取的血小板，经过分离、纯化、冻融或涨破、离心等过程后，仍能较好地保留血小板膜蛋白，并在包覆于纳米载体表面后发挥其原有的生理特性[16]。该类递药系统为纳米载体提供一层生物伪装外衣，在提高生物相容性和免疫逃逸能力的同时，还可以利用血小板膜上的游离氨基或者羧基进行化学修饰，赋予该载体系统更加丰富的功能。
在血小板膜包覆的纳米仿生递药系统研究中，加州大学圣地亚哥分校张良方教授团队开展了具有开创性的研究。他们利用静电吸附，通过物理超声的方法在聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米粒表面包覆了一层约15nm厚的单层血小板膜外衣，免疫印迹试验(Westernblot)检测结果显示血小板膜蛋白(包括免疫调节蛋白、整合素以及其他穿膜蛋白等)大多数较完整的保留于血小板膜上[16]。
3、血小板及其膜仿生递药系统的特点
3.1提高生物相容性，延长药物体内循环时间
普通治疗药物在体内循环过程中，容易被机体免疫系统和代谢机制所清除，因而存在体内循环时间短，药物治疗量不足等问题，而采用聚乙二醇(PEG)修饰的方法进行改善，仍然可能产生“加速血液清除”(ABC)现象[17]。制备纳米粒的材料，虽具有一定的生物相容性，但在血液循环过程中，仍易激活血液中的补体系统，吸附血液中的蛋白形成蛋白干扰层[3-4]，弱化了功能性纳米粒的特异性，使其易被免疫系统所识别和清除。
血小板及其膜仿生递药系统可以利用血小板膜上调节免疫逃逸的CD47、抑制补体激活的CD55和CD59等提高其生物相容性，延长药物体内循环时间[16，18]。Hu等[16]通过阻断包裹在纳米粒表面的血小板膜上CD47受体，发现其被THP-1巨噬细胞吞噬量提高了1.6倍。在补体激活实验中，血小板膜包覆纳米粒也未出现明显补体激活现象。Wang等[13]通过将程序化死亡配体1(PDL-1)抑制剂接枝于未激活的天然血小板膜上，显著延长了PDL-1抑制剂在体内的半衰期，由原来的5h延长到35h。
3.2增加药物的稳定性，减少不良反应
蛋白多肽类药物在体内容易被酶水解失活，如组织中的蛋白质水解酶、组织蛋白酶、溶酶体、膜结合的氨肽酶，血液中的二肽酶Ⅳ(DAPIV)，后脯氨酶断裂酶(PPCE)等。将蛋白多肽类药物包裹或修饰在血小板膜仿生递药系统中，可以减少酶及外界条件的降解，从而增加药物的稳定性。
细胞毒性化疗药物对正常细胞具有严重的不良反应，将其装于血小板及其膜仿生递药系统中，可以有效减少化疗药物的脱靶毒性。例如，Xu等[15]将DOX包载于天然血小板内，在体外心脏毒性试验中，72h共孵育后，仍有80%心肌细胞存活，表现出较小的细胞毒性。
3.3增加药物的主动靶向性
血小板膜表面富含许多功能性蛋白，在肿瘤的生长与远端转移、血管损伤修复和病原微生物吸附结合方面有重要的作用。利用这些特点，可以增加血小板及其膜仿生递药系统的相关靶向性。
3.3.1肿瘤靶向性研究表明，血小板与肿瘤生长和转移过程密切相关[19]。肿瘤细胞会分泌激活因子直接激活血小板，并通过GPIIb-IIIa-纤维蛋白原(fibrinogen)以及P选择素-CD44与活化血小板结合，形成血小板-肿瘤异质聚集体，这种聚集体更易被微脉管所截留，从而为肿瘤生长提供了有利的场所[20]。同时，血小板形成的保护层为肿瘤细胞迁移提供了良好的免疫逃逸环境，并为肿瘤细胞迁移嫁接了MHCⅠ型配体，从而避免其被自然杀伤细胞(NKcell)识别和清除。
Hu等[18]用罗丹明标记血小板膜包覆的纳米粒，与人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)孵育2h后，用激光共聚焦显微镜观察到，包覆有血小板膜的纳米粒通过P选择素靶向肿瘤细胞膜上CD44受体的机制，不仅在细胞质聚集，在肿瘤细胞膜表面也有大量分布，而裸纳米粒仅在细胞质中聚集。体内动物实验表明，给药48h后，血小板膜包覆的纳米粒在肿瘤部位的蓄积量为裸纳米粒的1.9倍。
Li等[21]将肿瘤坏死因子凋亡相关配体(TRAIL)接枝于血小板膜包覆的二氧化硅纳米粒上，在肺转移瘤动物模型评价中，表现出高度的CTCs结合性，显著减少了肺转移瘤的形成。
3.3.2血管内皮损伤及血栓靶向性血小板在体内最主要的功能是参与血管损伤修复而止血。在血管损伤后凝血的第一阶段，血小板通过损伤血管壁释放的vWF结合到暴露的血管内皮下胶原蛋白上，同时血小板膜表面的GP-Ib-V-IX糖蛋白复合物介导其结合至vWF因子A1区的GPIbα配体结合蛋白，GPIbα促进血小板在高血流剪切力环境下吸附到损伤血管处[22-23]。随后被激活的血小板如同蜘蛛网般黏附到血管壁上并相互粘连，形成血小板栓，堵塞损伤部位。此外，血小板的激活提高了其表面GPIIb-IIIa整合蛋白的表达，作为和纤维蛋白原相结合的受体，促进了纤维蛋白和血小板的结合[24]。Hu等[16]利用该特性，将多西他赛担载于血小板膜包覆的聚合物纳米粒中，用于术后冠状动脉再狭窄的治疗。在SD大鼠血管损伤模型中，血小板膜包覆的多西他赛聚合物纳米粒可以在血管内皮损伤处大量蓄积，并可以滞留至少5d。Hu等[25]将溶栓药物组织纤维溶酶原激活剂(tPA)接枝于载有抗肿瘤药物的血小板膜包覆聚合物纳米粒表面，协同治疗多发性骨髓瘤及并发血栓。在肺血栓模型评价中，接枝有tPA的血小板膜包覆聚合物纳米粒表现出高于游离tPA组2倍的溶栓效果，这主要是由于血小板膜增强了tPA的血栓结合力，从而增加了tPA在血栓部位的蓄积量。
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3.3.3病原微生物靶向性血小板几乎和所有的病原微生物都有交互作用，并引起血小板的激活和聚集，如病毒、细菌、真菌和原生动物等。这些交互作用种类繁多，病原微生物表面的蛋白可以和血小板膜上的受体发生直接结合，也可以在二者之间通过血浆蛋白发生间接结合。在感染病原微生物后，病原微生物通过这种交互作用激活血小板，并引起大量血小板的吸附聚集。例如:链球菌通过其表面含有胶原蛋白样表位的血小板激活蛋白结合并激活血小板[26];幽门螺杆菌结合血浆中的vWF因子，再结合到血小板膜上的GPIbα[27]等。血小板膜仿生递药系统可以利用这种交互作用靶向病原微生物。
Hu等[16]将血小板膜包裹于PLGA纳米粒表面，作为万古霉素的递送载体。以MRSA252(一种耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌)为模型，该血小板膜仿生递药系统展现出良好的病原微生物靶向性。和裸纳米粒相比，血小板膜包裹的万古霉素纳米粒的结合力提高了12倍，只需要1/6游离万古霉素的剂量，就能达到同等的抑菌效果。
