多柔比星与槲皮素联载胶束逆转乳腺癌多药耐药研究

发布时间：2019-12-10

　　摘要目的:以聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PEG-PLGA)为载体，构建多柔比星(DOX)与槲皮素(QUE)的PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束，并对其逆转乳腺癌多药耐药效果进行评价。方法:采用透析袋法制备载PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束，并对该药物递送系统的理化性质、体外释放特性、药效学以及安全性进行系统评价。结果:所制得的PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束平均粒径为(58.2±5.6)nm，联载胶束中DOX与QUE的载药量分别为(9.12±0.97)%和(8.34±0.92)%;细胞摄取实验结果表明联载胶束中的QUE可有效抑制乳腺癌耐药(MCF-7/ADR)细胞对DOX的外排作用，且PEGPLGA/DOX+QUE联载胶束对MCF-7/ADR细胞的细胞毒性显著大于游离DOX、游离DOX+QUE及PEG-PLGA/DOX胶束;体内药效学结果显示PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束可有效抑制荷瘤小鼠皮下瘤生长，并且显示出良好的生物相容性。结论:PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束可有效逆转乳腺癌多药耐药，增强对耐药肿瘤细胞的毒性作用，是一种有应用前景的抗肿瘤药物递送系统。

　　关键词多柔比星;榭皮素;胶束;乳腺癌;肿瘤多药耐药

　　近年来，临床上针对肿瘤的治疗已经取得较大的进展，但是恶性肿瘤仍然是当今医学界尚未攻克的难关，患者死亡率依旧居高不下。研究发现，肿瘤化疗失败一个最重要的原因就是肿瘤多药耐药的产生。肿瘤多药耐药(multidrugresistance，MDR)是指肿瘤细胞将细胞内的药物排出，降低肿瘤细胞对药物的敏感性。其形成机制较为复杂，可能的机制包括以下几方面:药物摄取减少，外排增加;DNA修复机制增强;药物代谢途径改变;药物作用靶点突变;细胞凋亡途径失活或抗凋亡防卫系统过度活化等[1，2]。其中药物摄取减少，外排增加是肿瘤细胞产生MDR的主要原因，主要由ABC(ATPbindingcassette)膜转运蛋白家族的过度表达引起。ABC家族成员主要包括P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRPs)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)等[3，4]，这些蛋白作为ATP依赖性的药物外排转运体，可将多种结构不同的药物泵出细胞，显著减少抗癌药物在细胞内的蓄积，从而产生耐药性。针对临床上肿瘤多药耐药现象，采用的策略主要是将抗肿瘤药物与MDR逆转剂合用，从而来增加肿瘤对化疗药物的敏感性，以期望达到克服MDR的目的[5，6]。

　　槲皮素(QUE)是一种黄酮类抗氧化药，对炎症、肿瘤、病毒感染等疾病具有一定的治疗作用，研究发现QUE可降低多药耐药相关蛋白过度表达的肿瘤细胞对抗肿瘤药物的外排作用，具有逆转P-gp介导MDR的作用[7]。因此，QUE与多柔比星(DOX)联合应用或许可提高药物的抗耐药肿瘤疗效。但考虑到两种药物不同的物理化学及药动学特征[半衰期:DOX(16.1±6.67)h[8];QUE(4.16±2.97)h[9]]，需要借助制剂手段来实现两种药物的协同给药，其中纳米制剂(如纳米粒、脂质体、胶束等)广泛用于肿瘤药物的递送。

　　本试验以聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PEG-PLGA)为载体，采用透析袋法制备多柔比星与槲皮素(PEG-PLGA/DOX+QUE)联载胶束，并对其进行表征。围绕联载胶束的逆转多药耐药细胞与体内药效学进行进一步考察，并对其安全性进行初步评价。

　　1材料与方法

　　1.1仪器

　　MS-H-S-磁力搅拌器(武汉华科达实验设备有限公司);HPP5001激光粒度分析仪(英国马尔文仪器有限公司);F-2500荧光分光光度计(HITACHI，日本);MultiskanFC酶标仪(美国赛默飞世尔公司);CM-120透射电镜(荷兰皇家飞利浦);1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)。

　　1.2试药

　　多柔比星(DOX，大连美仑生物技术有限公司，批号:20170225);槲皮素(QUE，国药集团化学试剂有限公司，批号:20160515);聚乙二醇4000(PEG4000，西安瑞禧生物科技有限公司，批号:C1794-2831);聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA，西安瑞禧生物科技有限公司，批号:C1745-1332);二环己基碳二亚胺(DCC，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号:20170413);4-二甲氨基吡啶(4-DMAP，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号:20160225);甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

　　1.3动物

　　BALB/c裸鼠，SPF级，体质量18～20g，由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供，实验动物使用许可证号:SYXK(浙)2015-0009，动物含量合格证号:SCXK(沪)2012-0002。

　　1.4细胞

　　人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR，由南京凯基生物有限公司提供。

　　1.5方法

　　1.5.1PEG-PLGA的合成及表征精密称取PLGA(1.5g，0.001mol)、DCC(0.618g，0.003mol)和4-DMAP(0.04g，0.0003mol)，加入到20ml无水二甲亚砜(DMSO)中，搅拌30min以活化PLGA上的羧基，随后加入PEG(2g，0.001mol)，在N2保护下继续反应24h。反应结束后，将产物移至透析袋(MWCO3.5kDa)中，去离子水透析以除去水溶性副产物。收集透析袋中的混悬液离心(10000×g，10min)，取上清液冷冻干燥，即得PEG-PLGA，合成路线如图1所示。采用核磁共振氢谱(1HNMR)对PEG-PLGA结构进行确证。将PEG、PLGA和PEGPLGA分别溶于0.5mld6-DMSO中，使其最终浓度均为10mg·ml-1，用核磁共振仪记录核磁共振氢谱。以芘为荧光探针，采用荧光分光光度法测定PEG-PLGA在水溶液中的临界胶束浓度(CMC)[10]。

　　1.5.2PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束的制备分别将DOX和QUE溶于DMSO中配成1.0mg·ml-1母液，备用。精密称取PEG-PLGA分散于去离子水中，探头超声(400W，工作2s停3s)30次后形成空白胶束溶液，在磁力搅拌作用下，往该胶束溶液逐滴加入投药摩尔比为2∶1的DOX和QUE混合溶液。继续搅拌10min后转移至透析袋(MWCO3.5kDa)中，避光条件下纯水透析24h。将透析产物低速离心(4000×g)10min除去尚未被胶束包载的药物，取上清液冷冻干燥后，得到PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束备用，PEG-PLGA/DOX载药胶束同法制备[11，12]。

　　1.5.3PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束的理化表征取PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束适量，分散于去离子水中，配制成浓度为l.0mg·ml-1的胶束溶液，采用激光粒度仪考察PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束和PEG-PLGA/DOX载药胶束的粒径及多分散指数(PDI)。

　　另取适量PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束和PEG-PLGA/DOX载药胶束，用去离子水制成浓度为0.2mg·ml-1的胶束溶液，滴加在覆盖有碳膜的电镜铜网上，用滤纸吸去多余的液体后用2%(w/v)磷钨酸染色，干燥，透射电镜观察胶束的微观形态。1.5.4PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束的包封率和载药量测定采用有机溶剂提取法测定PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束中药物包封率[13，14]。本实验中采用DMSO来提取联载胶束中的药物，取100μlPEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束溶液(1mg·ml-1)与900μlDMSO混合，使包裹的药物溶解进有机溶剂中，分别采用荧光分光光度法和HPLC法来测定DOX和QUE的含量。另取PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束溶液0.4ml，置于超滤离心管(MWCO7.0kDa)中，4000×g高速离心20min后，对滤液中游离药物进行测定，PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束的包封率(EE%)和载药量(DL%)的计算公式如下:EE(%)=[(C-C0)×V/Mdrug]×100%;DL(%)=[(C-C0)×V/Mmicelles]×100%。

　　其中，C-载药胶束破坏后药物总浓度;C0-滤液中药物浓度;V-载药胶束体积;Mdrug-总投药量;Mmicelles-载药胶束质量。

　　1.5.5PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束的体外释放行为考察采用透析袋法考察PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束的体外释放行为[15]，分别以pH7.4和pH5.0PBS作为释放介质，将1ml胶束溶液移入透析袋(MWCO3.5kDa)中，置于含30mlpH7.4PBS溶液的释放管中，37℃恒温振荡下进行体外释放。在预设的时间点取样，经0.22μm微孔滤膜过滤后分别采用荧光分光光度法和HPLC法测定DOX和QUE浓度，计算药物的累积释放度，同法平行测3组。

　　1.5.6PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束的细胞摄取

　　本实验采用人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR作为模型细胞，考察游离DOX、游离DOX+QUE、PEG-PLGA/DOX载药胶束及PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束在细胞中的蓄积情况。将细胞以1×105·ml-1的密度接种于24孔细胞培养板中，与上述4组药物共孵育2h，DOX的终浓度均为10μg·ml-1，采用激光共聚焦显微镜观察细胞内DOX的蓄积情况。

　　1.5.7PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束的体外抗肿瘤活性研究采用MTT法评价PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束的体外抗肿瘤细胞药效[11]。以MCF-7/ADR作为模型细胞，分别给予游离DOX、游离DOX+QUE、PEG-PLGA/DOX载药胶束及PEGPLGA/DOX+QUE联载胶束进行处理，以未处理的空白细胞为对照，考察PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束的体外抗肿瘤效果。

　　1.5.8PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束的体内药效学及安全性研究以BALB/c裸鼠为模型动物，取对数生长期的MCF-7/ADR细胞的PBS溶液，皮下接种细胞。实验共分为5组，分别为生理盐水组、游离DOX组、游离DOX+QUE组、PEG-PLGA/DOX载药胶束组和PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束组(DOX10mg·kg-1)。肿瘤体积为100mm3时开始给药，隔天给药1次，连续给药4次，每2d利用游标卡尺测量肿瘤体积，并记录荷瘤小鼠体质量。此外，对主要脏器进行组织病理学检查。

　　1.6数据分析和统计

　　采用SPSS17.0软件进行统计分析，比较采用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1PEG-PLGA的合成及表征

　　对1HNMR图谱进行对比，在PEG-PLGA核磁共振氢谱上，存在PLGA上的CH3质子峰(1.5ppm)，同时存在PEG上的CH2CH2O质子峰(3.6ppm)，这说明PLGA与PEG成功嫁接形成PEG-PLGA。经芘荧光法测定，PEG-PLGA在水溶液中的CMC为22.7μg·ml-1，表明PEG-PLGA具有在水溶液中自发形成胶束的能力，可用于包载疏水性药物。具体见图2。

　　2.2PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束的理化性质评价

　　经激光粒度仪测定，PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束和PEG-PLGA/DOX载药胶束的粒径分别为(58.2±5.6)nm和(50.4±4.9)nm，PDI为(0.255±0.024)和(0.227±0.031)，差异均无统计学意义(P>0.05)。透射电镜结果显示，PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束和PEG-PLGA/DOX载药胶束均呈有规则的类球形结构，分布均匀，见图3。经测定，联载胶束中DOX与QUE的载药量为(9.12±0.97)%和(8.34±0.92)%，包封率为(84.52±2.47)%和(81.14±3.52)%。

　　2.3PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束的体外释放行为考察

　　结果如图4所示，PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束对所包载的药物具有明显的缓释作用，药物的持续释放可以维持在48h以上，且DOX和QUE的释放行为无显著差异。包载药物在pH5.0PBS中的释放速率要比在pH7.4PBS中快，这是由于PEG-PLGA在酸性条件下易于发生水解，使得胶束发生解聚，进而导致药物释放加快。

　　2.4PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束的细胞摄取如图5所示，PEG-PLGA/DOX+QUE组细胞荧光强度明显高于PEG-PLGA/DOX组，而游离DOX+QUE组高于游离DOX组，这说明QUE可通过抑制P-gp活性增加DOX在耐药细胞中的蓄积。图8荷瘤小鼠肿瘤的HE和TUNEL染色图片(200×)

　　2.5PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束的体外抗肿瘤活性研究

　　由图6中可以看出，相比于游离DOX，游离DOX+QUE和PEG-PLGA/DOX+QUE联载胶束显示出更高的细胞毒性(P<0.05)，说明QUE有助于增强DOX的抗肿瘤效果，结合细胞摄取实验结果，推测QUE通过抑制MCF-7/ADR细胞的P-gp活性，进而增加DOX在细胞内的蓄积，发挥协同抗肿瘤的作用。

　　2.6荷瘤小鼠药效学研究

　　荷瘤小鼠静脉给予不同制剂后的肿瘤体积如图7所示，生理盐水组肿瘤生长最快，而游离DOX、游离DOX+QUE、PEG-PLGA/DOX和PEG-PLGA/DOX+QUE载药胶束组的肿瘤体积均不同程度降低，且PEG-PLGA/DOX+QUE载药胶束对肿瘤生长抑制作用最为明显，显著高于其他各组(P<0.05)，进一步证实QUE对耐药细胞对抗肿瘤药物的外排作用，增加DOX的抗肿瘤活性;而游离DOX和游离DOX+QUE的肿瘤抑制作用较差，这与游离药物全身分布，进而导致药物在肿瘤部位分布较少有关。肿瘤HE染色结果显示(图8)，生理盐水组肿瘤细胞排列紧密，核大深染，而PEG-PLGA/DOX+QUE组的效果最为明显，出现空泡结构和组织坏死;游离DOX、游离DOX+QUE和PEG-PLGA/DOX组的抗肿瘤效果则相对较差。

　　荷瘤小鼠的体质量变化曲线如图9所示，相比于生理盐水组，游离DOX和游离DOX+QUE组的小鼠体质量显著下降(P<0.05)，而两种载药胶束组小鼠体质量下降不明显。游离DOX具有较强的营养和代谢系统毒性;而药物经胶束包载后可通过被动靶向和长循环作用增加药物在肿瘤部位的蓄积量及蓄积时间，同时减少药物在其他正常组织的分布，明显降低DOX的营养和代谢系统毒性，提高耐受性。DOX具有较强的心脏毒性，往往可引起不可逆性心肌病变，因此对心脏组织HE染色后观察，相比于生理盐水组，载药胶束组的心肌组织结构与生理盐水组无明显差异，而游离DOX和游离DOX+QUE组心肌纤维排列错乱，有较为明显的炎症细胞浸润，进一步说明载药胶束通过被动靶向机制，减少DOX在正常组织中的分布，从而降低药物的心脏毒性。具体见图10。

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