滇池中溶藻细菌的分离鉴定及其溶藻效应

发布时间：2019-11-28

　　摘 要：【背景】藻类水华或赤潮在世界范围内频发，带来各种危害，亟需找到有效途径控制水华或赤潮。溶藻细菌具有杀死藻类控制藻类生物量的能力，可以作为防治水华和赤潮的有效工具。【目的】分离并鉴定滇池中的铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)及其溶藻细菌，对溶藻菌作用于铜绿微囊藻的溶藻效应进行研究，初步了解其溶藻特性与溶藻机制。【方法】采用 LB 平板稀释涂布，再经多次划线分离纯化细菌，测定 16S rRNA 基因序列以鉴定细菌种类;采用毛细管分离的方法分离铜绿微囊藻，并测定其 cpcBA 基因序列以鉴定蓝藻种类;采用热乙醇法提取叶绿素 a，从而计算溶藻效率;基于过氧化氢酶(CAT)、还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)探究藻细胞在溶藻菌处理下的抗氧化系统响应。【结果】共分离获得 11 株微囊藻和 17 株针对铜绿微囊藻的高效溶藻菌。选取其中一株生长速度最快的铜绿微囊藻 DCM4 和一株溶藻效果最好的溶藻菌 Sp37 (Bacillus siamensis)进行后续研究。Sp37 对 DCM4 的 4 d 溶藻率达到 92.4%±1.5%，且对微囊藻属的水华微囊藻(M. flos-aquae)和惠氏微囊藻(M. wesenbergii)均有溶藻效果，而对绿藻没有溶藻效果。Sp37 的原菌液和无菌滤液对 DCM4 的 4 d 溶藻率分别为 86.8%±4.3%和 81.1%±2.2%，两者没有显著差异(P>0.05)。Sp37 菌体对 DCM4 的溶藻率为 25.4%±7.3%。Sp37 无菌滤液经不同温度和 pH 处理之后的溶藻率与未经处理的无菌滤液的溶藻率无明显差异。Sp37 无菌滤液处理藻细胞会使藻细胞的 CAT、GSH 和 MDA 含量发生变化。【结论】菌株 Sp37 对铜绿微囊藻 DCM4 具有高效的溶藻作用，而且对微囊藻属具有一定的溶藻特异性。Sp37 是通过分泌胞外物质间接溶藻，且溶藻物质具有热稳定性和酸碱稳定性。Sp37 无菌滤液处理藻细胞会触发藻细胞抗氧化系统，并且会损伤藻细胞膜。Sp37 无菌滤液很可能是通过对藻细胞造成氧化胁迫，最终导致藻细胞死亡的。

　　关键词：溶藻菌，铜绿微囊藻，叶绿素 a，杀藻物质，抗氧化系统

　　在海洋、湖泊和河流等水体中，藻类快速生长并聚集可引起赤潮与水华的发生。近年来，伴随着水体富营养化和气候变暖等环境问题的突出，水华与赤潮在世界范围内频发[1]。水华和赤潮可带来多种危害：藻类大量繁殖会堵塞管道，影响用水系统，降低水中溶解氧，影响水体中鱼类等生存;一些藻类还会产生藻毒素(如微囊藻毒素)，严重危害人类及周边其他生物的健康[2]。因此水华和赤潮问题亟待有效解决。藻类的控制和治理主要有物理法、化学法和生物法，在目前利用物理、化学等方法治理水华效果不理想或者容易产生二次污染的情况下，环境友好型的生物法为治理藻类提供了一条新的途径。目前，利用溶藻细菌进行水华和赤潮的治理成为国内外研究的热点[3-5]。

　　滇池是我国西南地区第一大淡水湖，有“高原明珠”之称。近些年来，滇池的富营养化程度加重，以铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)为优势种的蓝藻水华的暴发越来越频繁，造成每年 4–11 月均为水华发生期[6]，其中 7−9 月是水华发生的高峰期[7]。目前对滇池中蓝藻水华溶藻菌的研究仅限于溶藻方式、溶藻范围等。例如，从滇池分离并鉴定的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) DC-L5[8]、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis) DC-L14[9]、蜡状芽孢杆菌(B. cereus) YA1-1、蕈状芽孢杆菌(B. mycoides) YA2-3[10]等溶藻菌，发现是通过分泌胞外物质间接溶藻;史顺玉分离获得了对6株蓝藻及2株绿藻均有溶藻作用的溶藻菌假单胞菌(Pseudomona sp.) DC10[11]，这些研究对相关溶藻菌的溶藻机理均未作出阐释。本研究从滇池分离得到多株细菌，基于一株前期从滇池中分离获得的铜绿微囊藻进行溶藻菌的筛选，对其溶藻能力和方式作出阐释，并初步分析其溶藻特性和溶藻机理，以期为实现以溶藻菌控制滇池蓝藻水华提供优质的控藻菌资源与理论指导。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂和仪器

　　NaCl、酵母提取物、胰蛋白胨，北京索莱宝科技有限公司;FastDNA Spin Kit，MP biomedical 公司;DNA 通用纯化试剂盒，厦门鹭隆生物科技公司;PCR 反应体系中所用试剂和酶，TaKaRa 公司;引物，重庆擎科兴业生物技术有限公司。

　　人工气候培养箱，宁波东南仪器有限公司;天平、pH计，赛多利斯科学仪器有限公司;立式高速冷冻离心机，Tomy 公司;台式高速冷冻离心机， Beckman 公司;PCR 仪，郎基科学仪器有限公司;紫外可见分光光度计，岛津公司;多功能酶标仪， Bio-Tek 公司。

　　1.2 溶藻菌的分离鉴定与培养

　　细菌的分离：将采集的滇池水体梯度稀释后，涂布于 LB 固体平板培养基(LB 固体培养基(g/L)： NaCl 10.0，酵母提取物 5.0，胰蛋白胨 10.0，琼脂糖1.5，pH调整为7.0−7.2)，30 °C避光培养2−3 d。待菌落长出后，选取形态特征不同的单菌落，进行多次划线，最终获得纯菌。共获得 120 株细菌，将菌株用甘油冻存法保存于−80 °C。

　　细菌的鉴定：通过 16S rRNA基因测序鉴定。 PCR 引物为 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3′)和 1492R (5′-TACGGYTACCTTGTTACGACT T-3′)。PCR 反应体系(25 μL)：2.5 μL 10×PCR buffer (Mg2+ free)，2.5 μL MgCl2 (25 mmol/L)，0.5 μL dDTP，上、下游引物 10 μmol/L 各 0.5 μL，0.25 μL Taq 酶(5 U/μL)，2 μL DNA 模板，补足水至 25 μL。 PCR 反应条件：94 °C 5 min;94 °C 1 min，55 °C 1 min，72 °C 2 min，30 个循环;72 °C 5 min。取 2 μL PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后用凝胶成像仪检测电泳条带。PCR 产物送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。

　　细菌的培养：溶藻相关的研究中，细菌培养于 1/6 LB 液体培养基中，30 °C、180 r/min 培养。 LB 全营养培养基会对蓝藻的生长产生影响，LB 稀释实验结果显示，1/6 LB 对蓝藻的生长基本无影响，因此本研究中用于溶藻实验的细菌均培养于 1/6 LB 中。

　　细菌生长曲线的测定：取 200 μL 菌悬液接种于 20 mL 1/6 LB 培养基中，30 °C、180 r/min 培养，设 3 组平行;每隔 2 h 取样测定其在 600 nm 处吸光度(OD600);以 OD600 表征其生长情况，便于后续实验取样。

　　1.3 蓝藻的分离与培养

　　1.3.1 蓝藻的分离

　　所用蓝藻培养基为 BG11 培养基[12]。滇池水体偏碱性，pH 在 8.8−8.9 左右，因此将所用由滇池分离的藻种的培养基 pH 调至 8.8。采用镜检和毛细管分离的方法分离蓝藻：将水样和无菌水分别滴于载玻片上，在显微镜下观察，选择目标藻团，使用毛细管挑取水样中的藻团，放入一滴无菌水中，再从放入藻团的水滴中挑取目标藻团，以此类推直至挑取单个藻细胞或单个藻团为止。将最后获取的藻细胞接入备有 BG11 培养基的试管中培养。培养一个月后镜检如只有单一种类，则视为单藻分离成功，并富集培养为后续鉴定做准备。分离过程中所有器皿都经灭菌处理。

　　1.3.2 蓝藻的鉴定

　　藻类初步鉴定主要参考《浙江省主要常见淡水藻类图集(饮用水水源)》[13]，根据显微形态将滇池水样中微囊藻分离出，后续通过 cpcBA 基因进行微囊藻种类鉴定[14-15]。DNA 提取采用改良 CTAB 法进行[16];PCR 引物 PCβF (5′-GGCTGCTTGTTT ACGCGACA-3′)和 PCαR (5′-CCAGTACCACCAG CAACTAA-3′) [14]。PCR 反应体系(25 μL)：2.5 μL 10×PCR buffer (Mg2+ free)，2.5 μL MgCl2 (25 mmol/L)， 0.5 μL dDTP，上、下游引物 10 μmol/L 各 0.5 μL， 0.25 μL Taq 酶 5 U/μL，2 μL DNA 模板，补足水至 25 μL。PCR 反应条件：94 °C 5 min;94 °C 1 min， 55 °C 1 min，72 °C 2 min，30 个循环;72 °C 8 min;取 3 μL PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后用凝胶成像仪检测电泳条带。PCR 产物送由北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。

　　1.3.3 蓝藻的培养

　　采用 BG11 培养基在 28 °C、光照 3 000 lx、光暗比 14׃10 条件下培养。

　　1.3.4 蓝藻生长曲线的测定

　　将 5 mL 藻液接种于 100 mL BG11 液体培养基中，设 3 组平行;每隔 3 d 取样测定其叶绿素 a 含量和在 680 nm 处的吸光度(OD680);以 OD680 表征其大致生长情况和叶绿素 a 含量，便于后续实验取样。

　　1.4 溶藻菌的筛选

　　溶藻菌的筛选采用藻菌共培养的方法。将各菌株在上述培养条件下的菌悬液，取 1 mL 菌液以体积比 5% (体积比)等量加入 20 mL 藻液中，并以加入 1/6 LB 的藻液为对照，能使藻液黄化的菌株则为溶藻菌。选取其中溶藻作用快、溶藻效率高的菌株作为候选实验菌株。

　　1.5 细菌对藻细胞的溶藻试验

　　1.5.1 细菌对藻细胞的溶解作用

　　将细菌液体培养至稳定期，取 1 mL OD600约为 0.67 时(Sp37 接种于 1/6 LB 中生长至稳定期的 OD 值)的菌液按照 5% (体积比)添加到 20 mL 对数生长期的初始叶绿素 a 浓度约为 3.6 mg/L 的藻液(如无特别说明，后续实验中所用菌液均为 OD600 约为 0.67 的菌液，藻液均为叶绿素 a 浓度约为 3.6 mg/L 的藻液)中，并向相同藻液中加入等量 1/6 LB 作为对照，各设 3 组平行;每隔 12 h 取样，用于测定叶绿素 a 浓度。叶绿素 a 测定方法采用热乙醇法[17-18]。溶藻率计算方法为：Ae=(C0−Ct)/C0×100%。其中，Ae 是作用于蓝藻的溶藻率;C0 和 Ct 分别代表对照组和处理组的叶绿素 a 含量。

　　1.5.2 细菌的溶藻方式及溶藻物质的特性

　　溶藻方式：取稳定期的原菌液、无菌水洗涤 3 次并以 1/6 LB 重悬的菌体、用 0.22 μm 滤膜过滤的无菌滤液各 1 mL 分别按照 5% (体积比)添加进 20 mL 藻液中共培养，向相同藻液中加入等量 1/6 LB 作为对照，各设 3 组平行;于第 4 天取样进行叶绿素 a 的测定。

　　溶藻物质稳定性：将培养至稳定期的菌悬液过滤得到的无菌滤液的 pH 用 1 mol/L HCl 溶液和 1 mol/L NaOH 溶液分别调成 3.0、5.0、7.0、9.0、 11.0，在室温下处理 3 h 后调回原 pH，取 1 mL 无菌滤液以 5% (体积比)分别添加 20 mL 藻液进行共培养;将无菌滤液置于−20、40、60、80、100 °C 等温度下处理 3 h 后恢复至室温，取 1 mL 无菌滤液以 5% (体积比)分别添加进 20 mL 藻液进行共培养;加入未经任何处理的无菌滤液作为对照，每组设 3 个平行。共培养 4 d 后取样测定各组体系的叶绿素 a 浓度。

　　1.6 藻细胞经无菌滤液处理后的生理生化响应

　　将细菌培养至稳定期，取其无菌滤液 1 mL 与 20 mL 藻液进行共培养，设置 3 个平行样品，分别在 3、12 和 18 h 取样，取样之后去上清，用无菌水洗涤 3 次，将藻细胞保存于−80 °C 备用。根据试剂盒操作说明测定藻细胞过氧化氢酶 (CAT)、还原型谷胱甘肽(GSH)以及丙二醛(MDA) 的含量。各生理生化指标均利用南京建成试剂盒进行测定。

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　　2 结果与分析

　　2.1 微藻与溶藻细菌的分离鉴定

　　经鉴定一共获得 11 株微囊藻和 3 株绿藻，选取其中的铜绿微囊藻 DCM4、水华微囊藻 DCM1、惠氏微囊藻 DCM11、单针藻(Monoraphidium sp.) DCA4、栅藻(Scenedesmus sp.) DCA5 以及从日本购买的铜绿微囊藻 NIES-843 作为实验藻株。

　　从滇池水体分离出 17 株具有高效溶藻能力的细菌。本文选取其中一株作用速度快、溶藻效率高的菌株 Sp37。将 Sp37 的 16S rRNA 基因序列与 EzBioCloud 网站中已登录的 16S rRNA 基因序列进行核苷酸序列同源性比较，结果发现，Sp37 与多株芽孢杆菌(Bacillus)的相似性达 99%以上，其中与一株 Bacillus siamensis 的相似性最高，达 99.93%。据此将 Sp37 归于 Bacillus siamensis。Sp37 菌株的系统发育树见图 1。

　　2.2 菌株 Sp37 的生长曲线

　　将 Sp37 接种在液体 1/6 LB 中培养，每隔 2 h 取样，测定其 600 nm 处吸光度(OD600)，绘制生长曲线如图 2 所示。从图 2 中可以看出，Sp37 迟缓期在 0−6 h，对数生长期在 6−14 h，14 h 后进入稳定期。后续选取细菌浓度较高的稳定期进行溶藻相关试验。

　　2.3 菌株 Sp37 对铜绿微囊藻 DCM4 的溶藻效果

　　Sp37 对 DCM4 有明显溶藻作用(图 3)：在初始叶绿素 a 浓度约为 3.6 mg/L 的藻液中加入 Sp37，共培养 12 h 之后 DCM4 的生长就受到抑制，叶绿素 a 含量不再增加，共培养 1 d 后，溶藻率达到 42.7%±3.6%，说明菌株对铜绿微囊藻 DCM4 的溶藻效果非常好;共培养 4 d 后，铜绿微囊藻 DCM4 的去除率达到 92.4%±1.5% (图 3)，说明菌株 Sp37 对 DCM4 的溶藻效果很好。目前已有芽孢杆菌溶解藻的报道，包括芽孢杆菌能选择性杀死铜绿微囊藻[19-20]，短小芽孢杆菌(B. pumilus)对多种微囊藻有溶藻效果[8]。而本研究分离的溶藻菌 Bacillus siamensis Sp37 目前尚未有杀藻功能的相关报道。另外，目前所报道的关于溶藻菌研究中目标藻的初始叶绿素 a 含量都较低(0.5−1.0 mg/L)[20-21]，且溶藻所需要时间都较长(达到 80%的溶藻率，所需时间>7 d)[5,12]。本实验采用的供试藻叶绿素 a 的含量(3.6 mg/L)远高于自然水华的叶绿素 a 含量 (0.04−0.39 mg/L)[22-23]，而菌株 Sp37 能够在短时间内杀死该浓度的藻，这对以后 Sp37 的实际应用提供了更大的可能性。

　　2.4 菌株 Sp37 的宿主范围

　　为了确定Sp37的溶藻对象是否有一定的种类特异性，本研究选择了能引起水华的 3 株蓝藻及 2 株绿藻进行 Sp37 的溶藻实验，主要包括水华微囊藻 DCM1、惠氏微囊藻DCM11、铜绿微囊藻 NIES843、单针藻 DCA4、栅藻 DCA5。从表 1 中可以看出，菌株 Sp37 对微囊藻 DCM1、DCM11 和 NIES843 都有溶藻效果，其中对铜绿微囊藻 NIES843 的溶藻效果最好，在共培养 8 d 时溶藻效率为 99.8%±0.0%;对水华微囊藻DCM1和惠氏微囊藻DCM11也具有较好溶藻效果，在共培养第 8 天时溶藻率分别为79.4%±2.5%和 69.8%±1.8%;对绿藻中的单针藻 DCA4 和栅藻 DCA5 则没有溶藻效果。由此说明，菌株 Sp37 可能对微囊藻有选择性的溶藻作用，而不对其他藻产生危害。微囊藻是我国最常见的淡水水华蓝藻，也常产生微囊藻毒素[2,24]，微囊藻毒素是一种肝毒素，长期饮用含有微囊藻毒素的水源可能会引发肝癌。因此筛选出能够高效且迅速地溶解微囊藻的菌株，具有实际应用意义[25]。

　　2.5 菌株 Sp37 溶解铜绿微囊藻 DCM4 的作用方式以及溶藻物质的特性

　　溶藻细菌主要有直接溶藻和间接溶藻两种方式。为了研究菌株 Sp37 对铜绿微囊藻 DCM4 的作用方式，将 Sp37 的原菌液、洗涤后的菌体和无菌过滤液分别接入藻液进行共培养。共培养 4 d 后，各组都对 DCM4 有一定杀藻效果(图 4)。其中 Sp37 原菌液和无菌滤液的溶藻效果较好，4 d 后的溶藻率分别为 86.8%±4.3%和 81.1%±2.2%，两者没有显著差异(t-test，P>0.05);经无菌水洗过的菌体对 DCM4 的溶藻效果较差，溶藻率为 25.4%±7.3%。上述结果表明菌株 Sp37 的溶藻方式是间接溶藻，即通过释放某些溶藻活性物质杀死铜绿微囊藻 DCM4。经无菌水洗涤过后的菌体对 DCM4 也有一定的溶藻效果，可能是由于细菌在藻液中生长仍然能够分泌溶藻物质。目前已报道的溶藻菌主要都是通过分泌抑制藻类生长或者溶解藻细胞的胞外物质来间接攻击藻类，例如， Su 等分离到一株对甲藻有溶藻作用的交替假单胞菌，也是通过分泌活性物质溶藻[26];Skerratt 等分离到多株对甲藻有间接溶藻作用的细菌[3]; Yang 等分离了一株对铜绿微囊藻有较好的溶藻效果的地杆菌属溶藻菌[5]。

　　由上述结果可知，菌株 Sp37 不是通过细胞直接接触藻细胞攻击 DCM4，而是通过分泌溶藻物质杀死 DCM4。为了初步了解该溶藻物质的特性，对 Sp37 无菌滤液做了不同处理后再与 DCM4 进行共培养。图 5 结果显示，无菌滤液经不同 pH (3.0， 5.0，7.0，9.0，11.0)和温度(−20、40、60、80、100 °C) 处理之后的溶藻效率与未经任何处理的无菌滤液的溶藻效率没有显著差异(P>0.05)，说明 Sp37 分泌的胞外溶藻物质的活性在酸碱、冷冻和高温处理后并没有发生明显变化。由上述结果可知菌株 Sp37 分泌的溶藻物质具有酸碱稳定性和冷热稳定性，说明应该不是蛋白质或者多肽类物质。