一株鸡致病性大肠杆菌裂解性噬菌体的生物学特性及其对肠道菌群影响分析

发布时间：2019-10-12

　　摘 要：以实验室保存的鸡致病性大肠杆菌裂解性噬菌体EcP5为研究对象，采用双层琼脂平板法测定最佳感染复数(MOI)、一步生长曲线、热稳定性等生物学特性，研究不同接菌量对扩大培养的影响，分析不同灌服剂量对肠道菌群的影响。结果显示：EcP5的最佳感染复数为 0.001;对数生长期在 110~150 min 之间;在 pH7.0~10.0 范围内，噬菌体效价稳定;热稳定性较差，40 ℃作用2 h，滴度下降37.41%，60 ℃作用20 min噬菌体全部失活;EcP5裂解谱相对较宽，裂解率为 40.0%(18/45);扩大培养试验表明，当装液量为 70%，接菌量为 1.0 mL/100 mL，感染复数为 0.001，37 ℃ 180 r/min培养 3 h，4 ℃作用 24 h时噬菌体效价最高;灌服剂量为 0.25 mL/只时，EcP5对鸡肠道菌群和大肠菌群影响最小。本研究为后期的噬菌体治疗提供了理论依据。

　　关键词：大肠杆菌;裂解性噬菌体;生物学特性

　　大肠杆菌(Escherichia coli)是一种广泛存在于自然界的细菌，一般不致病，但有一些血清型、毒力因子、毒力岛等具有致病性，并能引起人和动物共同感染，是人畜共患病重要病原[1]。禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coil， APEC)可引起禽类的多种疾病，常表现为心包炎、肝周炎、腹膜炎、气囊炎、输卵管炎、滑膜炎以及败血症等症状[2]。Tivendale等[3]研究表明，APEC也可引起人在内的哺乳动物疾病，是潜在的人兽共患病病原。同时，鸡大肠杆菌耐药性日趋加重，孟志敏等[4]报道，河北省 156 株鸡源大肠杆菌分离株对恩诺沙星、诺氟沙星等17种药物的耐药性较高，耐药菌高达 70%以上;阮祥春等[5]报道，安徽省部分地区 75 株致病性大肠杆菌对阿米卡星和头孢唑肟对这些菌株高度敏感，高敏菌占70%以上。

　　目前公认的抗生素可用替代品有：抗菌肽、噬菌体、活菌制剂、益生元、中草药及其提取物、饲用酶制剂、酸化剂等[6]。其中，裂解性噬菌体在感染宿主菌之后一般不会将自身基因与宿主菌整合，而是导致宿主菌的裂解，常被用于生物防治、食品安全等领域[7]。本研究基于鸡致病性大肠杆菌防治的研究现状，以鸡致病性大肠杆菌裂解性噬菌体为材料，测定其生物学特性后进行初步应用，为后期的噬菌体防治奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细菌和噬菌体

　　鸡源致病性大肠杆菌及其裂解性噬菌体(EcP5)，由本实验室分离鉴定并保存。

　　1.1.2 试验动物

　　5日龄三黄鸡雏鸡60只购自石河子某孵化场。

　　1.1.3 主要试剂的配制

　　LB培养基按文献[8]配制;酵母浸粉、胰蛋白胨、琼脂粉均购于北京奥博星生物技术有限责任公司;氯化钠购自天津盛奥化学试剂有限公司;结晶紫中性红胆盐琼脂购自北京奥博星生物技术有限责任公司;平板计数琼脂购自陆桥技术有限责任公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 宿主菌的准备

　　将宿主菌从-80 ℃超低温冰箱取出置于4 ℃低温解冻。取 100 μL 宿主菌，接种于 5 mL LB 液体培养基，37 ℃ 160 r/min振荡培养8 h。将所得菌液做10倍倍比稀释，取不同稀释度的稀释液100 μL 均匀涂布于固体平板上，37 ℃培养过夜。次日对平板上的菌落计数(细菌浓度=平板上菌落数×稀释倍数×10(cfu/mL))。剩余菌液4 ℃保存备用。

　　1.2.2 噬菌体的准备

　　将EcP5从-80 ℃超低温冰箱取出置于4 ℃低温解冻。取噬菌体、宿主菌各100 μL，接种于5 mL LB 液体培养基，37 ℃ 160 r/min 振荡培养 8 h， 10 000 r/min 离心 10 min，取上清液，用液体培养基做10倍倍比稀释。从每个稀释度中取100 μL，通过双层琼脂平板法测定噬菌体效价，并将上清液 4 ℃保存备用。次日观察结果并计数(噬菌体滴度=噬菌斑数×稀释倍数×10(pfu/mL))。

　　1.2.3 最佳感染复数的测定

　　参照文献[9]，按照感染复数分别为 0.001、 0.01、0.1、1、10、100的比例将EcP5和宿主菌混合，再加入液体培养基使不同比例的培养基体系总体积一致。37 ℃ 160 r/min 振荡培养 3 h。取 1 mL 于 10 000 r/min 离心 10 min，取上清液，用液体培养基做 10 倍倍比稀释。通过双层琼脂平板法对 EcP5增殖液进行效价测定，获得最高效价的噬菌体/细菌比例即为最佳 MOI。同时设立不加宿主菌的噬菌体和不加噬菌体的宿主菌为对照组。

　　1.2.4 一步生长曲线的测定

　　参照文献[9]，将培养至对数生长期的宿主菌与 EcP5按照最佳感染复数混匀，在4 ℃放置15 min，然后将悬液置于 37 ℃振荡培养，同时开始计时，在 0 min、每隔 5 min(取 6次，30 min)、每隔 10 min (取 6 次)、每隔 20 min(取 6 次)取样，通过双层琼脂平板法测定噬菌体效价，绘制噬菌体感染宿主菌的一步生长曲线。

　　1.2.5 热稳定性的测定

　　参照文献[9]，将已知效价的 EcP5等体积分装若干，分别在 40、45、50、55、60 ℃条件下培养 2 h，于0、20、40、60、80、100、120 min分别取样，通过双层琼脂平板法测定效价。观察噬菌斑的形成情况，得到在不同温度、不同时间噬菌体的效价，绘制热稳定性曲线。

　　1.2.6 pH稳定性的测定

　　参照文献[9]，用浓HCl(1 mol/L)、NaOH(1 mol/L)调节 LB 液体培养基 pH 值，使 pH 值分别为 2.0、 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10、12，121 ℃ 15 min高压灭菌备用。分别取1 mL不同pH值的培养基于 EP 管内，同时接种 100 μL EcP5，37 ℃水浴孵育1 h，通过双层琼脂平板法测定效价。观察噬菌斑的形成情况，绘制pH稳定性曲线。

　　1.2.7 噬菌谱的测定

　　将 100 μL EcP5 分别与 100 μL 45 株不同鸡致病性大肠杆菌混合，静置 15 min。采用双层琼脂平板法观察噬菌斑的形成情况，得到噬菌体对不同鸡致病性大肠杆菌的裂解谱。

　　1.2.8 噬菌体扩大培养

　　按不同感染复数(10、1、0.1、0.01、0.001)将EcP5 和宿主菌混合加入到装有200 mL LB液体培养基的250 mL的锥形瓶中，加入的菌量为1.0 mL/100 mL，噬菌体等体积按感染复数添加。37 ℃ 160 r/min 振荡培养3~5 h，采用双层琼脂平板法测噬菌体效价;剩余液体4 ℃处理不同时间后测噬菌体效价，最终得出最佳培养方案。

　　1.2.9 噬菌体对肠道菌群的影响

　　将 60 只雏鸡随机分为 4 组(15 只/组)。3 组为 EcP5 饲喂组，编号为 a、b、c，EcP5 饲喂剂量依次为为0.25 mL/只、0.5 mL/只、1.0 mL/只;1组空白对照组。雏鸡12日龄时EcP5组人工灌服EcP5。

　　分别于灌服后5、7 d时每组解剖3只，称取1 g 肠内容物，用 100 mL生理盐水稀释后，取 1 mL稀释液梯度稀释，分别取 100 μL 涂布于结晶紫中性红胆盐琼脂、平板计数琼脂，37 ℃过夜培养后进行菌群计数(菌群数=平板上菌落数×稀释倍数×1 000(cfu/g))。

　　1.3 统计与分析

　　用SPSS 19.0进行单因素方差分析。

　　2 结果与分析

　　2.1 噬菌斑形态

　　采用双层琼脂平板法过夜培养后，肉眼可见直径相差不大，边缘整齐，无晕环、透明清晰的噬菌斑。

　　2.2 最佳感染复数测定结果

　　EcP5 最佳感染复数为 0.001，此时噬菌体效价为1.808×1010 pfu/mL(见图1)。

　　2.3 一步生长曲线

　　EcP5 培 养 150 min 后 ，效 价 达 到 峰 值 ，为 3.11×1010 pfu/mL，而后效价开始逐步下降。EcP5 的对数生长期在110~150 min之间。见图2。

　　2.4 热稳定性测定结果

　　EcP5 40 ℃处理120 min后效价下降37.41%; 55 ℃处理 20 min，效价下降 70.91%;60 ℃处理 20 min，效价下降 97.57%，认为 EcP5 已经失活。见图3。

　　2.5 pH稳定性测定结果

　　EcP5 在 pH7.0~10.0 之 间 效 价 都 维 持 在 较高水平。在酸性条件下，噬菌体效价下降严重。见图4。

　　2.6 裂解谱测定结果结果

　　表明，EcP5 的裂解率为 40.0%(18/45)，裂解谱较广。见表1。

　　2.7 扩大培养试验结果

　　在 250 mL 的锥形瓶中，装液量为 70%，接菌量 为 1.0 mL/100 mL，感 染 复 数 为 0.001，37 ℃ 160 r/min 培养 3 h，4 ℃作用 24 h 时 EcP5 效价最高，为3.9×109 pfu/mL。当感染复数小于0.1时，所得噬菌体原液浑浊;当感染复数大于 0.1时，噬菌体原液清亮，但效价较低。

　　相同装液量和感染复数下，37 ℃ 160 r/min培养3 h后，4 ℃作用2 h的EcP5效价比37 ℃ 160 r/min 培养 5 h 的效价高(见图 5)。相同条件下，37℃ 160 r/min培养 3 h后，4 ℃作用 24 h比作用 12 h的效果更好。感染复数为 0.001 时，4 ℃作用 24 h 后，EcP5效价呈现爆发式增长。见图6。

　　2.8 噬菌体对肠道菌群的影响

　　经单因素方差分析，灌服 EcP5 5 d 后，灌服剂量为 0.25 mL/只时，肠道菌群总数与对照组差异不显著(P>0.05)，肠道大肠菌群总数与对照组差异显著(P<0.05);灌服剂量为 0.5 mL/只时，肠道菌群总数与对照组差异极显著(P<0.01)，肠道大肠菌群总数与对照组差异极显著(P<0.01);灌服剂量为1.0 mL/只时，肠道菌群总数与对照组差异极显著(P<0.01)，肠道大肠菌群总数与对照组差异极显著(P<0.01)。见图7、图8。

　　经单因素方差分析，灌服 EcP5 7 d 后，灌服剂量为 0.25 mL/只时，肠道菌群总数与对照组差异不显著(P>0.05)，肠道大肠菌群总数与对照组差异显著(P<0.05);灌服剂量为 0.5 mL/只时，肠道菌群总数与对照组差异不显著(P>0.05)，肠道大肠菌群总数与对照组差异极显著(P<0.01);灌服剂量为1.0 mL/只时，肠道菌群总数与对照组差异显著(P>0.01)，肠道大肠菌群总数与对照组差异极显著(P<0.01)。见图9、图10。

　　灌服7 d，肠道菌群总数与大肠菌群总数较灌服5 d后略有上升，但依然低于对照组。

　　3 讨 论

　　鸡大肠杆菌病是由鸡致病性大肠杆菌引起的局部或全身性感染性疾病，包括大肠杆菌性败血症、肉芽肿、气囊病、心包炎、肝周炎、输卵管炎、卵黄性腹膜炎、脑炎、眼球炎和皮炎等[10]。大肠杆病菌属条件性致病菌，既能单一感染，又常在新城疫、禽流感、慢性呼吸道疾病等多种疾病发生过程中混合感染或继发感染，从而引起极高的发病率和死亡率，给养禽业带来严重经济损失[11]。噬菌体作为一种微生态制剂，可以有效地防治细菌性疾病，在医学、兽医学、食品业、养殖业和环控等方面得到了广泛的应用[12]。

　　根据本试验的结果得出，EcP5具有一定的应用价值。EcP5裂解谱相对较广;pH稳定范围较大，在pH7.0~10.0之间都比较稳定;生长迅速，130 min 可达到对数生长期，150 min 达到滴度峰值;最佳感染复数为0.001，杀菌效率较高。

　　在进行扩大培养过程中发现，当感染复数小于 0.1，经过 4 ℃作用后，噬菌体效价得到了大幅提高。这可能是由于在4 ℃时，细菌活性被抑制，但噬菌体仍处于活跃状态，从而获得了高效价的噬菌体。结果提示：细菌可能存在对抗噬菌体的机制，而这一机制在4 ℃时被抑制，该发现对噬菌体的扩大培养有较大影响，有待深入研究。

　　4 结 论

　　本研究就 EcP5 进行了初步应用，得出 EcP5 对肠道菌群的影响与噬菌体用量有关，用量为 0.25 mL/只时抑制作用最小，对肠道菌群影响最小。因此噬菌体灌服剂量应小于等于0.25 mL/只。

　　一株鸡致病性大肠杆菌裂解性噬菌体的生物学特性及其对肠道菌群影响分析相关论文期刊推荐：《生物学教学》(月刊)创刊于1958年，是由中华人民共和国教育部主管、华东师范大学主办的全国教育类核心期刊。主要刊载：“生物科学综述”、“生物学科技信息”、“教学参考”：国内外生物科学的新进展、新成果和具有应用参考价值的教学基础资料等内容。