嗅上皮基底细胞在嗅觉再生修复中作用及其机制研究进展

发布时间：2019-09-29

　　摘要 嗅上皮神经元与外界环境直接接触, 易受各种损伤而死亡, 但嗅上皮具有终生再生的能力, 能减缓嗅觉功能的退化。这种强大的再生能力主要依赖于嗅上皮的干细胞, 即球形基底细胞 (globose basal cells, GBCs)和水平基底细胞(horizontal basal cells, HBCs)。该文主要归纳整理了近年来关于这两种细胞的研究, 介绍它们在嗅上皮正常更新和损伤修复过程中的作用及机制, 为嗅觉功能减退的治疗研究提供理论依据, 也有利于进一步发掘它们在中枢神经系统修复治疗中的潜力。

　　关键词 嗅上皮; 神经发生; 干细胞; 水平基底细胞; 球形基底细胞

　　嗅觉是哺乳动物的重要感觉系统。正常的嗅觉能帮助机体寻找食物和水, 能够对火、泄露的燃气及变质的食物等发出的特殊气味产生警觉, 甚至能影响人类的行为和情感体验[1-2]。哺乳动物的嗅觉系统包括三个部分: 鼻腔和嗅上皮(olfactory epithelium, OE)、初级嗅觉器嗅球(olfactory bulb, OB)以及包括梨状皮质在内的高级嗅觉结构[3]。嗅上皮神经元直接暴露于外界环境, 易因物理、化学、生物等各种因素引起损伤, 导致嗅觉功能减退。一般而言, 哺乳动物的神经系统在损伤后难以恢复, 死亡的神经元无法再生, 也无法恢复原有的精细且特异地支配靶器官的功能。但嗅上皮是个特例, 它具有强大的终生再生能力, 损伤后嗅神经在解剖和功能上都能恢复[4]。这种强大的再生能力依赖于嗅上皮干细胞。嗅上皮干细胞能自我更新和定向分化, 产生嗅上皮内几乎所有的细胞类型。

　　除了嗅神经元之外, 哺乳动物嗅上皮中还有许多非神经类型的细胞, 可分为四大类。第一类是微绒毛覆盖的支持细胞(sustentacular cells, Sus cells), 特异性表达生物转化酶和细胞角蛋白8和 18[5-6]; 第二类是微绒毛细胞(microvillus cells, MV cells), 其数量较少, 散在于上皮表面, 呈梨形, 表面有呈束状的微绒毛突向鼻腔, 基底有一轴索状突起突入固有层, 该细胞的功能目前还不清楚, 推测可能为一类神经感觉细胞[7]; 第三类是鲍曼氏腺 (Bowman’s duct-gland units), 它是一种巨型多细胞体, 由导管/腺细胞(duct/gland cells, D/G cells)构成; 第四类是基底细胞群, 可以分为两大类: 水平基底细胞(horizontal basal cells, HBCs)和球形基底细胞 (globose basal cells, GBCs)[8]。水平基底细胞位于基底部, 在电镜下呈扁平椭圆形[9], 多数情况下处于静止状态。球形基底细胞则是由形态相似但具有不同分子表型和分化能力的细胞构成的异质细胞群。虽然水平基底细胞和球形基底细胞都被看作是嗅上皮中的干细胞, 但它们在嗅上皮发生和再生过程中扮演着截然不同的角色。

　　在哺乳动物中, 嗅神经元的寿命为30~90天。新生神经元由基底细胞分化而来, 补充衰老死亡的神经元, 从而维持嗅上皮细胞的内稳态[10-12]。分化成熟过程如下: 球形基底细胞从嗅上皮基底部向顶部迁移, 神经树突逐渐向嗅上皮鼻腔面生长, 在黏膜表面形成树突小结; 同时神经轴突穿过基底膜进入黏膜下层, 向嗅球方向生长, 在嗅球的嗅小球层与僧帽细胞的树突形成突触连接, 进一步分化为成熟嗅神经元。水平基底细胞在正常嗅上皮中保持静止状态, 一般只在嗅上皮受到一定程度损伤情况下被激活。这种再生过程的调控机制精确而复杂, 目前并不明朗。嗅神经元再生的调控机制对于研究中枢神经系统的损伤修复机制具有重要意义。本文就最近关于两种基底细胞在嗅上皮自我更新和损伤修复过程中的作用及机制的研究进行系统阐述。

　　1 球形基底细胞(GBCs)

　　1.1 球形基底细胞的干细胞潜能

　　球形基底细胞是嗅上皮特有的一类细胞。它们成簇聚集在水平基底细胞的表层, 细胞与细胞之间有很大空隙。胸腺嘧啶类似物和有丝分裂相关蛋白标记显示, 球形基底细胞是正常嗅上皮中主要的增殖群体[13-14]。使用荧光激活细胞分类术(fluorescence activated cell sorting, FACS)分离纯化球形基底细胞进行体外培养, 发现其能产生嗅上皮中几乎所有细胞类型, 包括神经元、支持细胞、导管/腺细胞和球形基底细胞乃至水平基底细胞[15-16]。球形基底细胞能自我增殖, 也能由水平基底细胞分化产生。他莫昔芬依赖的p63条件性敲除实验表明, 源自水平基底细胞的球形基底细胞也具有多向分化潜能和自我更新能力, 并能持续超过6个月产生嗅神经元[17-18]。球形基底细胞不仅负责嗅上皮神经元的自我更新, 也是轻微损伤以及选择性损伤嗅神经元后嗅上皮再生的主要细胞[19] 。

　　1.2 球形基底细胞的转录因子谱

　　球形基底细胞在嗅上皮发生和再生的不同阶段表达不同转录因子, 具有不同的分化潜能, 表达的转录因子主要有Sox2、Pax6、Ascl1、Neurog1 和NeuroD1等[20-22], 具体见表1。转录因子谱的差异在发育早期就已被确立, 并在成熟之后持续存在。 Sox2是公认的干细胞转录因子, 在水平基底细胞和球形基底细胞中都有表达, 对干细胞从激活到分化为神经元前体状态必不可少[23]。在神经发生过程中, Sox2能促进神经元前体细胞增殖, 增加其数量; 而 Pax6加速神经元的生成, 促进其分化[24]。在正常嗅上皮中, 表达Sox2和Pax6但不表达神经源性的螺旋– 环螺旋结构转录因子(Ascl、Neurog1和NeuroD1)的球形基底细胞可分为两种: 干细胞GBCSTEM(stem cell-like GBC)和多能干细胞GBCMPP(multipotent GBC)[25-26]。GBCSTEM的胸苷标记结果表明: 它不进行有丝分裂, 是一种持续标记细胞(label-retaining cells, LRC), 能表达p27; GBCMPP由GBCSTEM生成[14], 表达Ki67, 是一类增殖群体。Ascl1的表达促进球形基底细胞中的短暂扩充细胞向神经元分化, 而Ascl3的表达促进其向鲍曼氏腺细胞分化[27], Hes1 的表达则促进球形基底细胞向支持细胞分化。嗅神经元前体细胞(immediate neuronal precursor GBC, GBCINP)特异表达Neurog1和NeuroD1[24,28]。最后,未成熟神经元(GAP-43阳性)在5~7天内发育成为表达嗅觉标记蛋白(olfactory marker protein, OMP)的成熟嗅神经元[29]。而这种从干细胞到直接前体细胞的分化过程可被嗅上皮的直接损伤和嗅神经元的耗竭逆转。在正常或甲基溴(MeBr)损伤的嗅上皮中, 无论是原有的还是从正常嗅上皮中移植而来的球形基底细胞(Neurog1阳性)都只能向神经元分化; 而在嗅球切除术以及甲巯咪唑损伤后的嗅上皮中, 原有的和从正常上皮移植的Neurog1阳性球形基底细胞均可表达Sox2和Pax6, 表现出多向分化潜能: 产生的细胞虽仍以神经元为主, 但也有支持细胞等其他类型。同样地, Ascl1阳性细胞在损伤后恢复表达Sox2和 Pax6, 而且具有更强的多向分化潜能。Sox2是这种去分化过程的启动转录因子[28]。因此, 在嗅上皮中, 这种从干细胞到直接前体细胞的分化过程并非严格单向的。

　　1.3 Lgr5可特异标记球形基底细胞的干细胞群

　　球形基底细胞有多种标记物(表1)。迄今为止, 球形基底细胞中干细胞群的特异性标记物尚未确定。像Pax6、Sox2和Ascl1等分子并非特异表达于球形基底细胞。最近发现的成人干细胞的标记物 Lgr5(leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5)或许是一个较合适标记物。它在新生和成年小鼠的球形基底细胞中专一表达。而且Lgr5 阳性细胞维持嗅上皮的自我更新, 在正常或损伤嗅上皮中分化为多种细胞类型[33]。Lgr5是Wnt信号通路靶分子。Wnt通路已被证实在发育过程中参与了嗅上皮的增殖和神经发生, 能诱导干细胞向神经元分化[33,39]。在嗅上皮再生修复过程中, 敲除腺瘤性结肠息肉病(adenomatous polyposis Coli, APC)基因导致Wnt通路过度激活, 能使表达Lgr5的球形基底细胞大量增殖并促进神经发生; 而敲除β-链蛋白 (β-catenin)基因导致Wnt通路阻断时, 几乎完全没有神经发生。这表明, Wnt通路可促进Lgr5阳性球形基底细胞的增殖和随后的嗅上皮神经发生[20]。综合考虑Lgr5在嗅上皮中的表达模式, 以及在活性干细胞群中Lgr5和Wnt通路的功能[33,40], 认为Lgr5或许可以成为球形基底细胞中干细胞群的特异性标记物。

　　2 水平基底细胞(HBCs)

　　2.1 水平基底细胞的干细胞潜能

　　水平基底细胞是单层扁平细胞, 直接结合并紧密附着于基膜。它于胚胎发育晚期出现, 在出生后两周左右才形成完全分化的单层[41]。在未成熟嗅上 皮的发育过程中, 存在两次水平基底细胞源性神经发生高峰期, 分别在出生后10天和4个月。而其他时间段水平基底细胞基本保持静止状态[34]。如果把球形基底细胞看作活跃状态的干细胞, 则水平基底细胞可被认为是静息状态的干细胞。在正常嗅上皮中, 水平基底细胞数量较少, 寿命较长, 且大部分情况下处于静息状态。

　　水平基底细胞最初被称为嗅上皮中的干细胞[42], 是基于观察损伤后嗅上皮的形态学和组织培养结果。体外培养的损伤后嗅上皮水平基底细胞表达分子谱发生改变, 例如不再表达黏附受体β1, 并开始有丝分裂。在培养7天后, >90%的细胞死亡, 有<7%的细胞分化成了双极或多极细胞, 有2%~3%的细胞持续增殖, 在培养14天后扩大为小细胞簇(4~30个细胞) 和大细胞簇(100~1 000个细胞)。在含10% FBS培养液中, 较大的细胞簇(21~28天)产生了多分化形态的多迁移细胞, 具有神经元(如Nestin+ )和胶质细胞(如 S100+ )的表型[9,43]。之后通过各种遗传工具追踪发现, 水平基底细胞能够分化为嗅上皮中几乎所有细胞类型[19,34]。水平基底细胞表达角蛋白5(K5)和角蛋白 14(K14), 在其他组织上皮中, 有这两种标志的基底细胞往往是干细胞[44]。老年小鼠的嗅上皮损伤后, 水平基底细胞仍能从静止、扁平向增殖、锥样的形态转化, 这种增殖分化的能力不因小鼠衰老而改变[45]。从正常上皮纯化分离的水平基底细胞在体外培养时只能增殖不能分化[15], 只有在原处接受损伤刺激后移植才表现出干细胞潜能[18]。

　　目前有多种造成嗅觉损伤的模型。过于严重的嗅上皮损伤[如敌草腈(dichlorobenzonitrile, DCBN) 引起的损伤]会导致水平基底细胞发生呼吸道上皮化生(respiratory epithelium, RE)[46]; 而轻微的嗅上皮损伤或只损伤嗅神经元的嗅球切除术中, 大部分的水平基底细胞不能被激活。出现这种现象的原因可能是表面的球形基底细胞抑制了它们的活化[19]。吸入甲基溴(MeBr)能激活水平基底细胞, 是因为甲基溴能选择性杀死嗅神经元和支持细胞, 并减少其他非神经细胞数量。活化的水平基底细胞主要分化为球形基底细胞, 继而扩增分化成神经元和其他类型上皮细胞[17-18,36]。运用单细胞RNA测序结果表明支持细胞可从水平基底细胞直接分化产生[47]。水平基底细胞能否直接产生其他类型嗅上皮细胞有待进一步的研究。甲基溴损伤1天后, 嗅上皮大部分增殖的细胞是球形基底细胞, 而水平基底细胞(CK14标记) 则处于分化状态。甲基溴损伤的嗅上皮在6~8周后便可完全重建[24]。水平基底细胞在不同条件下的分化潜能如图1所示。

　　2.2 p63在调控水平基底细胞激活中的作用

　　目前对水平基底细胞的活化机制了解十分有限。值得注意的是, 水平基底细胞的活化往往伴随着或多或少的肿瘤蛋白p63(tumor protein p63, p63) 基因表达的下调, 包括mRNA水平和蛋白质水平[36]。 p63基因主要编码两类蛋白质, 一类保留了氨基末端的反式激活域, 即Tap63; 而在另一类中, 该结构域被剪接, 由外显子替换, 称?Np63。每一类又根据C 末端结构域的长度分为五种亚型, 从长到短依次为 α、β、δ、γ、ε。?Np63α蛋白亚型是嗅上皮p63编码的活化型。它在水平基底细胞中高表达, 而在其他细胞类型则不表达[17]。损伤刺激引起p63表达水平的下调, 继而水平基底细胞分化为球形基底细胞等各种细胞类型[17,36]。敲除p63基因的水平基底细胞能在未受损伤的条件下开始分化[47]; 因病毒感染而过表达?Np63α的嗅上皮在适宜损伤刺激后, 大部分水平基底细胞仍保持休眠静止状态。这些结果表明, p63的表达水平是决定水平基底细胞是否激活的主开关。在甲巯咪唑损伤模型初期, ?Np63表达的下调激活水平基底细胞, 使其分化为球形基底细胞。随着上皮逐渐修复, ?Np63的表达水平也逐渐上升, 使水平基底细胞从活化状态转为静止状态[18]。

　　2.3 水平基底细胞在损伤修复再生中的作用机制

　　水平基底细胞具有独特的初级纤毛, 能够调控自身的激活、增殖和分化[48]。支持细胞的终足与水平基底细胞的初级纤毛对接[41], 提示损伤信号可能通过纤毛由支持细胞向水平基底细胞传导。纤毛的功能与Notch、Wnt和Hedgehog等通路有关, 这些通路都与脑神经发生有密切联系[49-50]。Wnt和Notch通路在其他组织上皮中可以影响p63的表达水平[40,51]。如前所述, Wnt通路已被证实在发育过程中参与嗅上皮的增殖和神经发生[33,39], 能够诱导干细胞向神经元分化。Notch通路参与支持细胞的分化而非神经元的发生[47]。它能维持转录因子?Np63的水平, 从而维持水平基底细胞的休眠静止状态[28]。Notch1、 Notch2以及Notch通路的下游转录因子Hes1均在水平基底细胞中表达[18]。Hes1促进支持细胞分化形成[52]。这些结果表明, Notch通路是决定基底细胞是否向神经元分化的关键。虽然没有直接证据证明 Hedgehog通路参与嗅上皮的发生发展, 但Hedgehog 通路的众多组件动态定位于纤毛, 并且与其他系统的形态发生密切相关[53], 提示Hedgehog通路对于研究嗅上皮的损伤修复再生机制可能具有一定意义。

　　嗅上皮基底细胞在嗅觉再生修复中作用及其机制研究进展相关期刊推荐：《细胞与分子免疫学杂志》创刊于1985年，是由中国免疫学会和第四军医大学主办、国内外公开发行的免疫学专业学术性期刊。主要报道我国免疫学及相关学科的细胞和分子免疫学方面的理论及应用研究成果。主要读者为免疫学及相关学科的研究院所、大专院校、各医院和卫生防疫工作人员。