肿瘤免疫治疗中纳米制剂的研究进展
发布时间：2019-09-27
摘要：恶性肿瘤作为威胁人类健康的重大疾病，其治疗方法也一直是医学界关注的重点。近年来，肿瘤免疫治疗成为一种新型的治疗模式，然而其临床疗效由于肿瘤相关的免疫抑制及逃逸大幅减弱。纳米制剂给药系统可以提高免疫治疗效果，改变肿瘤微环境，为肿瘤治疗提供了有效的策略。重点介绍了几种基于纳米制剂的抗肿瘤免疫治疗方法。
关键词：肿瘤;纳米载体;免疫治疗
目前，恶性肿瘤仍然是威胁人类健康的主要因素之一。传统的治疗方法有手术、化疗、放疗等，这些治疗模式虽然在延长患者生存时间等方面具有一定意义，但仍具有不可忽视的局限性。将肿瘤进行手术切除虽然在癌发早期具有一定的效果，但是大多数癌症在早期难以发现，对中晚期患者而言切除病灶不仅大大增加肿瘤转移的风险，还会对机体造成一定程度的损伤。化疗和放疗虽然可以很大程度上杀伤肿瘤细胞，但是由于缺乏选择性，正常组织和细胞也受到了损伤，不良反应严重[1]。近年来，越来越多的研究者将研究重点转移至肿瘤免疫治疗，并取得了显著的成就。肿瘤免疫治疗是通过激活、调动机体免疫系统来杀灭肿瘤细胞与肿瘤组织的一种治疗方法。相较于传统的治疗方法，肿瘤免疫治疗具有明显的特异高效性，同时可以大幅减少治疗肿瘤免疫治疗中纳米制剂的研究进展毛静，单晓甜，邱立朋，张慧杰，陈敬华江南大学药学院，无锡 214122 摘要：恶性肿瘤作为威胁人类健康的重大疾病，其治疗方法也一直是医学界关注的重点。近年来，肿瘤免疫治疗成为一种新型的治疗模式，然而其临床疗效由于肿瘤相关的免疫抑制及逃逸大幅减弱。纳米制剂给药系统可以提高免疫治疗效果，改变肿瘤微环境，为肿瘤治疗提供了有效的策略。重点介绍了几种基于纳米制剂的抗肿瘤免疫治疗方法。关键词：肿瘤;纳米载体;免疫治疗 DOI:10.3969/j.issn.1674-0319.2018.06.012 的副作用，有望成为肿瘤治疗的主流方法。
1 免疫治疗策略
肿瘤免疫治疗通常分为免疫检查点阻断治疗、肿瘤疫苗治疗、过继免疫治疗等。在抗肿瘤免疫反应过程中，T细胞活化之后，其表面高表达的抑制性调节受体与癌细胞表面相应的受体特异性结合，从而调节免疫反应的强度。这些具有抑制性调节作用的特殊位点被称为免疫检查点(immune checkpoint)，如细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA- 4)、程序性死亡受体(PD-1)、T淋巴细胞弱化因子(BTLA)等[2-3]，其中以PD-1研究最为深入，并且取得了显著效果。目前已有许多PD-1抑制剂上市 ：阿特朱单克隆抗体(atezolizumab)、纳武单克隆抗体(nivolumab)、帕母单克隆抗体(pembrolizumab)等。肿瘤疫苗治疗主要是将肿瘤抗原导入患者体内，增强机体对肿瘤的识别能力，启动特异性细胞免疫，从而杀灭肿瘤细胞。目前的肿瘤疫苗主要有抗原疫苗、细胞疫苗、基因疫苗等。抗原疫苗又主要以蛋白疫苗为主。Clifton等[4]对E75、GP2和AE37三种肿瘤疫苗进行研究，临床试验结果表明 ：E75可以有效地控制患者的病情同时降低复发率，AE37对抑制癌细胞转移具有显著效果。基因疫苗是在真核质粒上负载抗原基因，将质粒导入宿主细胞表达出相应的抗原蛋白之后，激活机体的特异性免疫，达到杀伤肿瘤细胞的目的。
2 免疫抑制微环境
健康组织的微环境能够有效地预防肿瘤的发生，但是肿瘤细胞可以促使免疫细胞发生迁移，招募成纤维细胞，重塑基质以及形成新的血管网络来改变微环境，从而更利于自身的生长和迁移[5]。
炎症反应是肿瘤微环境的重要特征之一。巨噬细胞主要包括M1型(经典化巨噬细胞)和M2型(替代活化巨噬细胞)两种。肿瘤微环境中的肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、γ干 扰素(interferon-γ，IFN-γ)等可以诱导巨噬细胞向M1 型转化。同时，巨噬细胞在细胞因子IL-4、IL-10、 IL-13的作用下可以向M2型转化。肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages，TAMs)在肿瘤微环境中发挥着关键作用，其功能与M2型巨噬细胞十分相似。肿瘤微环境可以利用刺激因子将巨噬细胞吸引至肿瘤组织周围，继而转化为TAMs，促进恶性肿瘤的生长迁移。 TAMs可以通过分泌肾上腺髓质素(ADM)、血管内皮生长因子(VEGF-A)、碱性成纤维细胞生长因子等促进新生血管的生成。此外， TAMs还可以降解胞外基质，为癌细胞的生长和迁移提供充足的营养。Chiarugi等[6]通过试验发现去甲肾上腺素可以通过激活β3肾上腺素受体来改变黑色素瘤微环境 ：募集相关成纤维细胞，促进巨噬细胞向 TAMs转化，为黑色素瘤的生长迁移提供条件。
在肿瘤微环境中肿瘤相关成纤维细胞(cancerassociated fi broblasts，CAFs)发挥着不可或缺的作用，可以由正常成纤维细胞转化而成。与正常的成纤维细胞相比，CAFs具有很强的增殖能力，同时胞外基质增长速度增快。Lee等[7]利用异种移植模型发现Twist1的表达对CAFs分化是充分必要的。在正常成纤维细胞中强制表达Twist1可以促进CAFs标记物在胃癌细胞中的表达以及在体内表现出肿瘤恶性特征。相反，在CAFs中沉默Twist1的表达则消除了其促进肿瘤的特性。除此之外，肿瘤微环境中还存在着一种重要的免疫细胞 ：髓系来源抑制性细胞(myeloid derived suppressor cell, MDSC)，该细胞属于骨髓细胞家族。在肿瘤微环境中，MDSC逐渐分化为粒细胞、肿瘤相关巨噬细胞等，可以促进血管的生成。
3 纳米制剂免疫治疗策略
纳米技术兴起于20世纪80年代，并已逐渐进入医药领域，现如今已广泛应用在药物给药系统。用作给药系统的纳米载体粒径一般在1000nm以下，可以通过肿瘤的EPR效应滞留在肿瘤部位，实现被动靶向给药。同时，纳米材料表现出良好的药物负载能力，可以将大量的药物携载至肿瘤部位，提高药物对肿瘤的杀伤作用。将药物包载至纳米载体可以有效地提高药物的血清稳定性，并有效降低副作用。将其应用于肿瘤免疫治疗方面，纳米载体同样展现出了显著优势。
3.1 有机纳米粒子
PLGA纳米粒子由于其生物安全性好、药物包载率高、易于成球等优势广泛应用于药物载体。 Cruz等[8]用PEG对PLGA进行修饰后包载免疫抗原，用于抗原对树突细胞(dendritic cells，DCs)靶向激活策略的研究。DCs表面覆盖有大量的CD40受体、 TNF-α家族受体、DEC-205受体、C-type凝集素受体、 CD11c受体。体外试验结果显示，与非靶向性的纳米粒子相比，PLGA-(Ag/TLR3+7L)具有更好的靶向性和入胞性。与DEC-205以及CD11c靶向纳米粒子相比，CD40靶向纳米粒子入胞量较少，但有显著改善。与非靶向纳米粒子相比，所有靶向纳米粒子均通过DCs刺激IL-12的产生和共刺激分子的表达，在体外诱导T细胞大量增殖以及IFN-y的高表达。此外，动物试验结果显示 ：皮下注射CD40、DEC-205 和CD11c靶向纳米粒子始终比非靶向纳米粒子更能刺激CD8+ T细胞应答，从而诱导靶向细胞裂解。综上所述，与注射非特异性纳米粒子疫苗相比，注射细胞表面靶向纳米粒子疫苗，可以显著增强疫苗效力，诱导T细胞应答。Iranpour等[9]用PLGA包载晚期乳腺癌患者的癌细胞裂解液来研究其促进DCs成熟的作用，用 Bradford 蛋白测定法和 SDS-PAGE 检测法分别测定 PLGA 纳米粒子的包封率以及经 PLGA 纳米粒子释放的抗原的稳定性。两者均显示 PLGA 纳米粒子具有良好的性能。蛋白质抗原经 PLGA 纳米粒子包载之后，可以有效诱导 DCs 的刺激应答和成熟，加速抗原加工速度、保持抗原免疫原性、提高抗原稳定性，同时还可以靶向传递和缓慢释放抗原。
作为给药系统的一员，胶束一直被广泛用于抗癌给药载体。Wilson等[10]设计了一种具有pH敏感的两亲性纳米胶束，该胶束包载CpG ODN和硫代蛋白抗原(ovalbumin，OVA)后粒径在23nm左右。相较于直接使用OVA，将其包载至纳米胶束可以显著增强体外抗原的交叉表达。对小鼠进行皮下注射，试验结果显示 ：纳米胶束包载OVA后CD8+ T 细胞反应明显增强。与单独使用游离的CpG以及使用游离的OVA和CpG复合物的制剂相比，纳米胶束双载OVA和CpG后，CD8+ T细胞反应分别增强18和8倍。综上所述，该研究表明具有pH敏感性、内源性的纳米胶束双载OVA和CpG ODN后，可以有效促进抗原的交叉表达，增强细胞和体液免疫反应的能力。
抗原虽然可以诱导DCs激活，但有时效率并不高。在黑色素瘤患者中，即使存在大量的免疫原性抗原，TDLNs中DCs的成熟和激活也会受到抑制，从而抑制了免疫反应。Thomas等[11]认为，仅对TDLNs提供佐剂就可能利用TDLNs与肿瘤之间的相互作用，潜在地逆转免疫抑制微环境向炎症性细胞转移并激活DCs。为了验证这一点，他们制备了PPS纳米颗粒，通过CpG寡核苷酸在TDLNs中激活DCs并逆转免疫抑制。NPs可在同侧给药后靶向TDLNs，激活DCs，逆转免疫抑制，最终增加 CD4+ 、CD8+ T细胞浸润到肿瘤中。为了能在TDLNs 中定向靶向到DCs，纳米载体的设计至关重要。现已证实载体颗粒大小在间质间隙淋巴吸收中起重要作用。Reddy等[12]研究了直径为20nm、45nm和 100nm的PEG-PPS纳米颗粒，以靶向淋巴结DCs。他们发现，20nm和 45nm的纳米颗粒即使在注射 120h后仍可以保持较高的血药浓度，而且20nm的纳米颗粒最容易吸收到淋巴管中。此外，即使没有靶向配体，大约有一半的PEG-PPS颗粒被TDLNs中的DCs吸收，表明20nm和45nm的PPS纳米颗粒具有靶向TDLNs中DCs的潜力。
3.2 脂质体
胆固醇和磷脂在水中充分分散会形成一种与细胞双分子层结构十分相似的膜性小泡，这种膜性小泡被称为脂质体。包载药物之后，脂质体特有的双层膜结构可以提高药物的稳定性，同时可以发挥缓释的作用，从而延长药物作用时间，降低药物使用剂量。另外，由于其毒性小、可生物降解的特点，脂质体发展成为一种优良的药物载体。在肿瘤微环境下，具有pH敏感性的脂质体不稳定，容易裂解，与此同时，脂质体内吞进入细胞后与溶酶体膜发生融合，包载在脂质体中的免疫抗原就会释放到细胞质中引起免疫反应。为了建立基于肽疫苗的肿瘤免疫疗法，Yoshizaki等[13]用3-甲基戊二酰化超支化聚(MGlu-HPG)修饰的脂质体诱导抗原特异性免疫反应。脂质体内包载来自OVA-I或OVA-Ⅱ的肽，分别对DCs上的MHC I和MHCⅡ具有特异性识别作用。载有体外OVA-1肽的MGlu-HPG修饰的脂质体比携带E.G7-OVA肿瘤的小鼠中的游离OVA-I更能有效地实现CTL活化。载有体外OVA-1肽的MGluHPG修饰的脂质体能更能有效地实现CTL的活化。此外，MGlu-HPG修饰的脂质体包载OVA-I对小鼠注射后，可以明显观察到肿瘤体积的抑制，而包载 OVA-Ⅱ的MGlu-HPG脂质体显示出低得多的肿瘤抑制作用，这可能是由于OVA-Ⅱ肽是用于诱导OVA特异性CD4+ T细胞的产生。iNKT细胞被认为是癌症免疫治疗的一个很重要的靶点。经糖脂质抗原或细胞因子激活后，iNKT细胞可直接诱导肿瘤细胞溶解，但也可通过快速产生促炎性细胞因子诱导先天和适应性免疫系统其他成分的细胞毒性机制来诱导抗肿瘤免疫应答[14]。Khan等[15]将从鞘氨醇单胞菌中分离出的鞘糖脂载入纳米脂质体，这类鞘糖脂可以像α-GalCer一样特异性激活iNKT细胞。在骨髓来源 DCs以及小鼠试验中，相较于直接使用鞘糖脂，包载入脂质体的鞘糖脂均表现出良好的效果 ：大量分泌IFN-γ以及抗肿瘤诱导效果更为显著。
YSK05是一种人工合成的pH敏感脂质，具有高度的膜融合活性，而且可以通过溶酶体逃逸促进基因沉默[16]。Miyabe等[17]利用YSK05作为疫苗载体(c-di-GMP/YSK05脂质体)，用环二核苷酸作为佐剂，通过STING-TBK1-IRF3通路刺激先天免疫系统。体外和体内试验结果表明，在APCs中c-diGMP/YSK05实现了cyclic-di-GMP的胞质传递以及促进IFN-β的产生，导致CD80和MHC I表达增加， CTL活性升高。这些结果表明脂质体可以作为免疫给药系统的一种良好的选择。
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