论HPLC法测定脂质体中足叶乙苷的含量研究
发布时间：2013-08-12
0.引言
足叶乙苷，是目前临床上应用广泛的一线抗癌药，通过抑制哺乳类动物DNA拓扑异构酶Ⅱ的活性发挥抗肿瘤效应，具有广谱抗癌活性。其水溶性较差(溶解度58.7μg/ml，20℃)，为改善其溶解性能，注射液中添加了吐温-80，静脉注射给药存在一定的风险性;同时制剂存在毒副作用大、药物分布广泛等问题，限制了临床上的广泛使用[2,3]。为了延长足叶乙苷在体内的滞留时间，提高疗效，将其制成脂质体制剂。为控制足叶乙苷脂质体的质量，本文应用HPLC法进行足叶乙苷脂质体含量测定研究。
1.仪器和试药
Dionex型高效液相色谱系统(P680型泵，PDA-100型检测器，ASI-100自动进样器)，SynergiC18色谱柱(250μm×4.6cm，广州菲罗门)，足叶乙苷对照品(批号100388-200401，中国药品与生物制品检定所)，卵磷脂ePCS(德国Lipoid公司)，胆固醇(中国医药公司北京采购供应站)，聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG2000-DSPE，德国Lipoid公司)，TritonX-100(北京中山生物技术有限公司)，足叶乙苷(北京双鹤药业，批号2007081105)。甲醇、乙腈为色谱纯，其他药品、试剂均为国产分析纯。
2.方法和结果
2.1 足叶乙苷脂质体的制备[4]
将卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂乙醇胺以摩尔比10:5:0.3精密称定，溶于足叶乙苷热乙醇液中，保温(55±2)℃，边搅拌边匀速注入乙醇液至10mLpH7.4磷酸盐缓冲液(PBS,0.05mol/L)中，注入过程中通入N2除去大部分乙醇。注入完毕后，探头式超声3min，依次过0.8和0.45μm的微孔滤膜，即得足叶乙苷脂质体。实验室制备3批脂质体样品(080905、080907、080911)。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取足叶乙苷对照品适量，加流动相制成每1mL含84μg的溶液，即得。
2.3 供试品溶液的制备
取足叶乙苷脂质体样品0.1mL于5mL容量瓶中，加入0.2mL20%TritonX-100乙醇溶液，超声使其澄清，流动相定容至刻度，即得。
2.4 检测波长的确定
对足叶乙苷对照品溶液进行最大吸收的波长扫描，记录色谱图，足叶乙苷的最大吸收波长在285nm处，故选择此波长为足叶乙苷的检测波长。
2.5 色谱条件
色谱柱：Phenomenex SynergiC18柱(4.6mm×25cm,5μm)，流动相：甲醇-0.2%NaAc-HAc缓冲液(pH4.0,3:2,V/V)，流速：1.0ml/min，检测波长：285nm，进样量：20μl。
2.6 空白脂质体干扰测定
取空白脂质体0.1mL，照供试品溶液的制备方法配制黄柏空白脂质体液，精密吸取该空白对照液、足叶乙苷脂质体供试液以及足叶乙苷对照品溶液各20μl，按上述色谱条件进行测定，结果空白脂质体液在足叶乙苷保留时间内无干扰峰出现，辅料和破膜剂对足叶乙苷的测定无干扰。
2.7 标准曲线与线性范围
精密称取足叶乙苷对照品适量，用流动相溶解定容，制备成浓度为0.21mgmL-1的足叶乙苷贮备液，精密量取上述贮备液，用流动相稀释成浓度分别为10.5，21，42，84，126，168μgmL-1的系列标准品溶液，按照上述色谱条件进行操作。用测得的峰面积A与其浓度C进行回归，得到回归方程为A=0.1122C+0.2559，r=0.9990，结果表明足叶乙苷进样量在10.5～210μgmL-1之间，线性关系良好。
2.8 精密度试验
精密量取足叶乙苷对照品溶液(84μg/mL)20μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，测定峰面积，RSD值为1.39%。
2.9 稳定性试验
取批号080905样品按含量测定项下制备供试品溶液，精密量取供试品溶液20μl，按上述色谱条件注入液相色谱仪，每隔2h测定1次，供测定6次，峰面积RSD为1.46%，表明样品溶液在10h内稳定性良好。
2.10 加样回收率试验
取4支5mL容量瓶，编号为1°~4°，分别加入脂质体(080905批次)0.1mL和20%TritonX-100(乙醇液)0.2mL，如不澄清可适当在50℃水浴加热。2°~4°加入已知浓度的标准样品各5mL，流动相定容至刻度，各进样3次。按浓度的计算量和实际加入量比值，计算加样回收率。结果见表1。
2.11 样品测定
测定3批足叶乙苷脂质体样品，取0.1mL于5mL容量瓶中，加入0.2mL20%TritonX-100乙醇溶液，超声使其澄清，流动相定容至刻度，注入HPLC分析。药物含量测定结果见表2。
3.讨论
应用甲醇-水系统作为足叶乙苷样品流动相，发现峰有拖尾现象，因足叶乙苷pKa值为9.5，存在微量电离。醋酸盐缓冲液调节pH值后，峰形较好，最终采用甲醇-醋酸盐缓冲液pH4.0(6:4)为流动相体系[5]。
在脂质体药物测定的过程中，破膜剂能否将脂质体破坏完全很关键[6]。本文尝试用甲醇、乙醚等有机溶剂，结果发现溶液不够澄清，破膜不完全。最终采用20%TritonX-100作破膜剂。
