棉花胚性愈伤组织研究
发布时间：2016-09-30
体细胞胚胎发生是植物研究合子胚生长发育的理想模型，同时也是农杆菌介导的遗传转化技术需要借助的重要过程，一般情况下包括愈伤组织诱导、胚性愈伤组织分化、胚状体分化及植株再生四个过程[1]。棉花是通过体细胞胚胎发生方式获得再生植株困难的物种。
摘要：为了利用多胺促进棉花体细胞胚胎发生，提高农杆菌介导的棉花遗传转化效率，本研究以4个陆地棉品种新陆早33号(L33)、新陆早36号(L36)、新彩棉7号(C7)、豫早1号(Y1)为试验材料，下胚轴在附加有0.1mg/L2，4-D和0.1mg/LKT的MSB培养基中培养4周后，分别继代到附加了1mmol/L腐胺(Put，Putrescine)、1mmol/LD-精氨酸(D-Arg，D-Arginine，多胺合成抑制剂)和对照的3种分化培养基中培养4周后，记录愈伤组织的增殖和分化情况。结果表明：D-Arg可以显著抑制愈伤组织增殖，4个品种都表现出严重的褐化，而附加Put则能够一定程度地促进愈伤组织的增殖。
关键词：棉花;腐胺;胚性愈伤组织
目前仅有为数不多的棉花品种(基因型)通过体细胞胚胎发生过程获得了再生植株，限制了棉花的转基因研究和应用[3]。大量研究表明，影响体细胞胚胎发生的因素很多，其中基因型和植物激素是最重要的两个原因[4]。近年来，多胺作为一种重要的生长调节物质在诸多方面开展了研究。现有研究表明，多胺含量的升高是体细胞胚发生前提[5]，且认为植物激素对体细胞胚胎发生的影响是通过多胺介导的，其中多胺起到“第二信使”的作用[6]。Kumar等[7]研究表明在胚性愈伤组织中Spm、Spd的含量均明显高于非胚性愈伤组织，程文翰等[5]发现在棉花胚状体形成期亚精胺和精胺含量显著上升，保持高比例的Put/(Spd+Spm)有利于胚性细胞的产生[7-13]。此外，外源添加多胺能够促进云杉的体细胞胚胎发生[14]，而多胺在棉花组织培养上的应用尚未见报道。
胚性愈伤组织的分化是棉花体细胞胚胎发生的关键环节之一，本研究通过对不同体细胞胚胎发生能力的棉花品种进行多胺和多胺抑制剂处理，观察多胺对棉花组织培养过程中胚性愈伤组织分化的影响，以期为改良棉花转基因技术提供一定参考。
1材料与方法
1.1植物材料
不同体细胞胚胎发生能力的4个陆地棉品种豫早1号(Y1)、新彩棉7号(C7)、新陆早33号(L33)和新陆早36号(L36)为本实验供试品种，其体细胞胚胎发生能力由强至弱，由石河子大学棉花研究所提供。
1.2方法
1.2.1棉花组织培养种子去壳后，用0.1%的升汞消毒10min，无菌水清洗3-5次;接种于无菌苗培养基(1/2MS大量元素+15g/L葡萄糖+6.5g/L琼脂粉)，28℃暗培养5-6d备用。将无菌苗下胚轴切为0.5-0.7cm的小段，接种于愈伤组织诱导培养基(MSB附加0.1mg/L2，4-D+0.1mg/LKT)。
4周后，继代于生长素减半的胚性愈伤组织诱导培养基上。1.2.2多胺和多胺抑制剂处理胚性愈伤组织诱导培养基(MSB附加0.05mg/L2，4-D+0.1mg/LKT)，设为3种处理，分别为CK、附加1mmol/L的腐胺Put和1mmol/L的多胺抑制剂D-Arg，6周后继代至胚性愈伤诱导培养基(MSB附加0.05mg/L2，4-D+0.1mg/LKT)，并统计3种处理条件下愈伤组织的日增重量;继代培养4周后，统计胚性愈伤组织分化率，胚性愈伤组织分化率(%)=每个品种每个处理中分化胚性愈伤组织的下胚轴数目/每个品种每个处理中接种的下胚轴数目，每个品种每个处理接种28个下胚轴，3次重复。
1.2.3多胺含量测定准确称取棉花愈伤组织0.4-1.0g(定量);将称取好的材料放入预冷的研钵，加入5mL预冷的5%高氯酸冰浴研磨(分3次加入：2、2、1mL)，将研磨液转移至离心管，涡旋2min;冰浴浸提1-1.5h;浸提液4℃、12000r/min离心20min;取500μL上清液，加入7μL苯甲酰氯、1mL的2mol/LNaOH，涡旋30s，37℃水浴反应25min;在反应液中加入2mL饱和NaCl、2mL乙醚，涡旋1min后5000r/min离心5min;收集1mL离心后的乙醚相于1.5mL离心管中，真空抽滤40min;加入100μL甲醇震荡5min，静置溶解1h;8000r/min离心1.5min，收集至安培瓶，加甲醇定容至500μL，待HPLC检测。色谱柱选择WatersC18反相柱，流动相为甲醇：水(60∶40v/v)，流速1mL/min，进样量10μL，检测温度30℃，检测波长为254nm，保留时间为20min。外标法计算，峰面积使用Empower2数据处理软件处理。
2结果与分析
2.1多胺对愈伤组织增殖的影响
不同体细胞胚胎发生能力品种的愈伤组织状态不同，其中发生能力最强的Y1表现为棕色稀泥状的愈伤状态，且其愈伤组织增殖缓慢，随着体细胞胚胎发生能力的下降，愈伤组织增殖加快(图1)。多胺抑制剂和腐胺处理后，愈伤组织形态发生明显变化。
多胺抑制剂D-Arg可以显著抑制愈伤组织增殖，4个品种都表现出严重的褐化(图1)，愈伤组织的日增重均少于对照(图2)，仅为对照的16.78%-50.97%。除了Y1外，附加腐胺(Put)可以不同程度地促进愈伤组织的增殖，最多可以增加10.57%。此外，附加腐胺对愈伤组织的形态影响较大，愈伤组织多表现有利于胚性愈伤组织分化的稀泥状(图1)。
2.2多胺对胚性愈伤组织分化的影响
经多胺抑制剂D-Arg和Put处理6周后继代于胚性愈伤诱导培养基上，培养4周后统计胚性愈伤组织分化率。对照处理条件下，C7的胚性愈伤组织分化率最高，其次是Y1和L36，L33的胚性愈伤组织分化率最低。多胺抑制剂D-Arg处理后，L33和L36均未见胚性愈伤组织分化(图3)，C7的胚性愈伤组织分化率仅为对照的49.38%，Y1的胚性愈伤组织分化率则为对照的324%，但胚性愈伤组织分化量少，推测Y1在D-Arg处理前胚性细胞团已经存在。Put处理后，所有品种的胚性愈伤组织分化率均表现为提高，其中Y1和L33两个品种表现最为突出，Put处理后胚性愈伤组织分化率提高了3倍多。上述结果表明，对于Y1、C7和L33而言，腐胺可以显著促进棉花胚性愈伤组织的分化，可以考虑在愈伤组织形成后通过添加腐胺促进棉花胚性愈伤组织分化。
2.34个品种在不同处理条件下的多胺含量测定利用高效液相色谱法(HPLC)对4个品种在不同处理条件下培养6周后的愈伤组织进行多胺含量测定。由图4可见，不同品种在腐胺和D-Arg处理后多胺含量变化趋势不同。其中，C7和L33表现出相同的变化趋势，D-Arg处理后多胺含量上升，腐胺处理后多胺含量最高，可能与腐胺处理后胚性愈伤组织分化率明显提高有关。L36表现出与C7和L33相反的变化趋势，D-Arg和腐胺处理均会降低愈伤组织的多胺含量。Y1则在D-Arg处理后多胺含量最高，可能与D-Arg处理后胚性愈伤组织分化率大幅提高有关。
结果表明，外施腐胺或多胺抑制剂D-Arg之后，愈伤组织多胺含量都会发生变化，但不同品种之间的表现存在差异。
3讨论
(1)本研究利用4个不同体细胞胚胎发生能力的棉花品种为材料，对诱导4周后的愈伤组织进行腐胺和多胺抑制剂D-Arg处理，6周后考察愈伤组织增殖、胚性愈伤组织分化率以及愈伤组织多胺含量的变化情况。不同品种的愈伤组织对多胺或D-Arg的反应不同，可能与不同品种在诱导愈伤组织时期的反应不同有关，不同状态的愈伤组织经多胺或D-Arg处理后导致愈伤组织增殖、胚性愈伤组织分化率和内源多胺含量的不同。其中，Y1的愈伤组织经D-Arg处理后，愈伤组织日增重仅为对照的50.97%，表明多胺抑制剂能够显著地抑制愈伤组织的增殖，但胚性愈伤组织分化率却为对照的3.24倍，而其他3个品种的愈伤组织日增重和胚性愈伤组织分化率均有显著下降。其可能原因是愈伤组织在增殖的不同时期，Y1正好处于增殖早期，分化能力最强，而其他3个品种的愈伤组织已经进入增殖后期，分化能力下降;另一可能原因是Y1在愈伤诱导阶段胚性细胞团已经存在，在D-Arg处理后非胚性细胞的增殖和分化受到抑制，而胚性愈伤组织由于已经存在并能进行增殖。因此，多胺对胚性愈伤组织分化也只有在适当时期才会发挥促进作用。
(2)Y1、C7在3种处理下的愈伤日增重显著低于比L33、L36，而在胚性愈伤分化过程中，Y1、C7在3种处理下的分化率显著高于L33、L36，表明愈伤组织增殖与胚性愈伤组织的分化呈现一定的负相关性。其可能原因是疯长型愈伤组织增殖快，消耗大量营养，对具有分化能力的胚性愈伤造成营养竞争，最终使胚性愈伤因“饥饿”而不能分化或分化能力减弱[15]。与Y1、C7相比，L33、L36在生长中产生了大量非胚性愈伤或者疯长型愈伤组织，这些愈伤组织生长快，但难以进行胚性愈伤组织分化，在后期表现出较低的胚性愈伤组织分化率。
参考文献：
[1]杨玲，高翔翔，沈海龙，等.植物体细胞胚胎发生研究进展[J].世界林业研究，2008，21(3)：16-20.YANGLin，GAOXiangxiang，SHENHailong，etal.Progressinresearchofplantsomaticembryogenesis[J].WorldForestryResearch，2008，21(3)：16-20.
[2]武秀明，刘传亮，张朝军，等.棉花体细胞胚胎发生的研究进展[J].植物学通报，2008，25(4)：469-475.XiumingWu，ChuanliangLiu，ChaojunZhang，etal.Progressofsomaticembryogenesisincotton[J].ChineseBulletinofBotany，2008，25(4)：469-475.
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